Zuilvormige structuur van menselijk telomerisch chromatine

Bron: Nature

Natuur volume 609, Pagina’s1048–1055 ( 2022 ) Citeer dit artikel

Abstract

Telomeren, de uiteinden van eukaryote chromosomen, spelen een cruciale rol bij veroudering en kanker en zijn het doelwit van DNA-schade en de reactie op DNA-schade 1 , 2 , 3 , 4 , 5. Er is weinig bekend over de structuur van telomeer chromatine op moleculair niveau. Hier gebruikten we negatieve kleurelektronenmicroscopie en magnetische pincetten met één molecuul om 3 kbp lange telomere chromatinevezels te karakteriseren. We hebben ook de cryogene elektronenmicroscopiestructuur verkregen van het gecondenseerde telomere tetranucleosoom en zijn dinucleosoomeenheid. De structuur vertoonde een dichte stapeling van nucleosomen met een kolomvormige opstelling en een ongewoon korte nucleosoomherhalingslengte die ongeveer 132 bp DNA omvatte, gewikkeld in een continue superhelix rond histon-octameren. Deze kolomstructuur wordt voornamelijk gestabiliseerd door de H2A carboxy-terminale en histon amino-terminale staarten op een synergetische manier. De kolomvormige conformatie resulteert in blootstelling van de DNA-helix, waardoor deze vatbaar kan worden voor zowel DNA-schade als de reactie op DNA-schade. De conformatie bestaat ook in een alternatieve open toestand, waarin één nucleosoom wordt ontstapeld en naar buiten wordt geklapt, waardoor de zure plek van het histonoppervlak wordt blootgelegd. De structurele kenmerken die in dit werk worden onthuld, suggereren mechanismen waarmee eiwitfactoren die betrokken zijn bij het onderhoud van telomeren, toegang hebben tot telomerisch chromatine in zijn compacte vorm.

Code beschikbaarheid

De code die wordt gebruikt voor MMT-analyse is beschikbaar op https://doi.org/10.5281/zenodo.6810919 .

Beschikbaarheid van data

Cryo-EM-dichtheidskaarten voor mono-NCP ( EMD-31806 ), Di-NCP ( EMD-31810 (3,9 Å), EMD-31908 (5 Å), EMD-31907 (4,6 Å)), open Di-NCP ( EMD -31815 (4,5 Å), EMD-31909 (6,6 Å)), Tri-NCP ( EMD-31816 ), open Tri-NCP ( EMD-31826 ), open Tetra-NCP ( EMD-31832 ) en Telo-tetra ( EMD -31823 ) zijn gedeponeerd in de Electron Microscopy Data Bank. Uitgeruste modellen voor mono-NCP ( 7V90 ), Di-NCP ( 7V96 ), open Di-NCP ( 7V9C ), Tri-NCP ( 7V9J ), open Tri-NCP ( 7V9S ) en open Tetra-NCP (7VA4 ) en Telo-tetra ( 7V9K ) zijn gedeponeerd in de Protein Data Bank. Ruwe niet-bijgesneden gels worden geleverd in aanvullende figuur 1 . Brongegevens worden bij dit document geleverd.

Referenties

  1. Palm, W. & de Lange, T. Hoe shelterin telomeren van zoogdieren beschermt. Annu. Eerwaarde Genet. 42 , 301-334 (2008).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  2. Pisano, S., Galati, A. & Cacchione, S. Telomere nucleosomen: vergeten spelers aan chromosoomuiteinden. Cel. mol. Levenswetenschappen. 65 , 3553-3563 (2008).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  3. Hewitt, G. et al. Telomeren zijn favoriete doelwitten van een aanhoudende reactie op DNA-schade bij veroudering en door stress veroorzaakte senescentie. Nat. gemeenschappelijk. 3 , 708 (2012).Artikel ADVERTENTIES PubMed Google geleerde 
  4. Takai, H., Smogorzewska, A. & de Lange, T. DNA-schadehaarden bij disfunctionele telomeren. Curr. Biol. 13 , 1549-1556 (2003).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  5. Longhese, MP DNA-beschadigingsreactie op functionele en disfunctionele telomeren. Genen ontwikkelaar 22 , 125-140 (2008).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  6. Samassekou, O., Gadji, M., Drouin, R. & Yan, J. Grootte van de uiteinden: normale lengte van menselijke telomeren. Ann. Anat. 192 , 284-291 (2010).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  7. Blasco, MA De epigenetische regulatie van telomeren bij zoogdieren. Nat. Ds. Fr. Genet. 8 , 299-309 (2007).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  8. d’Adda di Fagagna, F. et al. Een checkpoint-reactie op DNA-schade bij door telomeren geïnitieerde senescentie. Natuur 426 , 194-198 (2003).Artikel ADVERTENTIES PubMed Google geleerde 
  9. Widom, J. Een relatie tussen de spiraalvormige draai van DNA en de geordende positionering van nucleosomen in alle eukaryote cellen. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 89 , 1095-1099 (1992).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  10. Valouev, A. et al. Determinanten van nucleosoomorganisatie in primaire menselijke cellen. Natuur 474 , 516-520 (2011).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  11. Robinson, PJJ & Rhodes, D. Structuur van de ’30 nm’ chromatinevezel: een sleutelrol voor de linker histon. Curr. mening. structuur. Biol. 16 , 346-343 (2006).Artikel Google geleerde 
  12. Garcia-Saez, I. et al. Structuur van een H1-gebonden 6-nucleosoomarray onthult een niet-getwiste twee-start chromatinevezelconformatie. mol. Cel 72 , 902-915 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  13. Song, F. et al. Cryo-EM-onderzoek van de chromatinevezel onthult een dubbele helix die is verdraaid door tetranucleosomale eenheden. Wetenschap 344 , 376-380 (2014).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
  14. Ekundayo, B., Richmond, TJ & Schalch, T. Vastleggen van structurele heterogeniteit in chromatinevezels. J Mol. Biol. 429 , 3031-3042 (2017).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  15. Robinson, PJJ, Fairall, L., Huynh, VAT & Rhodes, D. EM-metingen bepalen de afmetingen van de “30-nm” chromatinevezel: bewijs voor een compacte, in elkaar grijpende structuur. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 103 , 6506-6511 (2006).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  16. Kruithof, M. et al. Krachtspectroscopie met één molecuul onthult een zeer flexibele spiraalvormige vouwing voor de 30-nm chromatinevezel. Nat. structuur. mol. Biol. 16 , 534-540 (2009).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  17. Konrad, SF, Vanderlinden, W. & Lipfert, J. Kwantificering van epigenetische modulatie van nucleosoomademhaling door high-throughput AFM-beeldvorming. Biophys. J. 121 , 841-851 (2022).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
  18. Bedoyan, JK, Lejnine, S., Makarov, VL & Langmore, JP Condensatie van telomeerspecifieke nucleosomale arrays van ratten met ongewoon korte DNA-herhalingen en histon H1. J. Biol. Chem. 271 , 18485-18493 (1996).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  19. Makarov, VL, Lejnine, S., Bedoyan, J. & Langmore, JP Nucleosomale organisatie van telomeer-specifiek chromatine bij ratten. Cel 73 , 775-787 (1993).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  20. Soman, A. et al. Het menselijke telomere nucleosoom vertoont duidelijke structurele en dynamische eigenschappen. Nucleïnezuren Res. 48 , 5383-5396 (2020).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  21. Luger, K., Mader, AW, Richmond, RK, Sargent, DF & Richmond, TJ Kristalstructuur van het nucleosoomkerndeeltje met een resolutie van 2,8 Å. Natuur 389 , 251-260 (1997).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
  22. Vasudevan, D., Chua, EY & Davey, CA Kristalstructuren van nucleosoomkerndeeltjes die de ‘601’ sterke positioneringssequentie bevatten. J Mol. Biol. 403 , 1–10 (2010).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  23. Pisano, S. et al. Telomere nucleosomen zijn intrinsiek mobiel. J Mol. Biol. 369 , 1153-1162 (2007).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  24. Huynh, VAT, Robinson, PJJ & Rhodes, D. Een methode voor de in vitro reconstitutie van een gedefinieerde “30 nm” chromatinevezel die stoichiometrische hoeveelheden van het linkerhiston bevat. J Mol. Biol. 345 , 957-968 (2005).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  25. Brouwer, T. et al. Een cruciale rol voor linker-DNA bij het vouwen van chromatinevezels van hogere orde. Nucleïnezuren Res. 49 , 2537-2551 (2021).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  26. Paus, LH et al. Uitrekken van één enkele chromatinevezel onthult fysiek verschillende populaties van demontagegebeurtenissen. Biophys. J. 88 , 3572-3583 (2005).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  27. Korolev, N., Lyubartsev, AP & Nordenskiöld, L. Een systematische analyse van nucleosoom kerndeeltje en nucleosoom-nucleosoom stapelstructuur. Sci Rep. 8 , 1543 (2018).Artikel ADVERTENTIES PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  28. Dorigo, B. et al. Nucleosoomarrays onthullen de twee-startorganisatie van de chromatinevezel. Wetenschap 306 , 1571-1573 (2004).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
  29. Koopmans, WJA, Buning, R., Schmidt, T. & van Noort, J. spFRET met behulp van afwisselende excitatie en FCS onthult progressief uitpakken van DNA in nucleosomen. Biophys. J. 97 , 195-204 (2009).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  30. Huang, Y.-C. et al. Het effect van linker-DNA op de structuur en interactie van nucleosoomkerndeeltjes. Zachte materie 14 , 9096-9106 (2018).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
  31. Tatchell, K. & Van Holde, KE Compacte oligomeren en nucleosoomfasering. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 75 , 3583-3587 (1978).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  32. Bowerman, S., Wereszczynski, J. & Luger, K. Archaeal chromatine ‘slinkies’ zijn inherent dynamische complexen met afgebogen DNA-wikkelroutes. eLife 10 , e65587 (2021).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  33. Mattiroli, F. et al. Structuur van op histon gebaseerd chromatine in Archaea. Wetenschap 357 , 609-612 (2017).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  34. Edayathumangalam, RS, Weyermann, P., Gottesfeld, JM, Dervan, PB & Luger, K. Moleculaire herkenning van de nucleosomale “supergroef”. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 101 , 6864-6869 (2004).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  35. Vancevska, A., Douglass, KM, Pfeiffer, V., Manley, S. & Lingner, J. De reactie op telomerische DNA-schade treedt op bij afwezigheid van chromatine-decompactie. Genen ontwikkelaar 31 , 567-577 (2017).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  36. Cacchione, S., Biroccio, A. & Rizzo, A. Opkomende rollen van telomere chromatineveranderingen bij kanker. J. Exp. Clin. kanker res. 38 , 21 (2019).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  37. Skrajna, A. et al. Uitgebreide nucleosoom-interactome-screening stelt fundamentele principes van nucleosoombinding vast. Nucleïnezuren Res. 48 , 9415-9432 (2020).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  38. Liu, WH et al. Multivalente interacties stimuleren nucleosoombinding en efficiënte chromatine-deacetylering door SIRT6. Nat. gemeenschappelijk. 11 , 5244 (2020).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  39. Court, R., Chapman, L., Fairall, L. & Rhodes, D. Hoe de menselijke telomere eiwitten TRF1 en TRF2 telomeer DNA herkennen: een weergave van kristalstructuren met hoge resolutie. EMBO Rep. 6 , 39-45 (2005).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  40. Willhoft, O. et al. Structuur en dynamiek van het gist SWR1-nucleosoomcomplex. Wetenschap 362 , eaat7716 (2018).Artikel PubMed Google geleerde 
  41. Hübner, B. et al. Ultrastructuur en nucleaire architectuur van telomeer chromatine onthuld door correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. Nucleïnezuren Res. 50 , 5047-5063 (2022).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  42. Fajkus, J. & Trifonov, EN Kolomvormige pakking van telomere nucleosomen. Biochem. Biophys. Res. Comm. 280 , 961-963 (2001).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  43. Luger, K., Rechsteiner, TJ & Richmond, TJ Bereiding van nucleosoomkerndeeltje uit recombinante histonen. Methoden Enzymol. 304 , 3-19 (1999).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  44. Dyer, PN et al. Reconstitutie van nucleosoomkerndeeltjes uit recombinante histonen en DNA. Methoden Enzymol. 375 , 23-44 (2004).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  45. Schindelin, J. et al. Fiji: een open-source platform voor biologische beeldanalyse. Nat. Methoden 9 , 676-682 (2012).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  46. OriginPro v.2019 (OriginLab Corp., 2019).
  47. Ou, HD et al. ChromEMT: visualisatie van 3D-chromatinestructuur en -verdichting in interfase- en mitotische cellen. Wetenschap 357 , eaag0025 (2017).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  48. Zhou, BR et al. Herbezoek van gereconstitueerde 30-nm nucleosoomarrays onthult een ensemble van dynamische structuren. J Mol. Biol. 430 , 3093-3110 (2018).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  49. de la Rosa-Trevin, JM et al. Scipion: een softwareraamwerk voor integratie, reproduceerbaarheid en validatie in 3D-elektronenmicroscopie. J. Structuur. Biol. 195 , 93-99 (2016).Artikel PubMed Google geleerde 
  50. Zivanov, J. et al. Nieuwe tools voor geautomatiseerde cryo-EM-structuurbepaling met hoge resolutie in RELION-3. eLife 7 , e42166 (2018).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  51. Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: snelle en nauwkeurige schatting van onscherpte op basis van elektronenmicrofoto’s. J. Structuur. Biol. 192 , 216-221 (2015).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  52. de la Rosa-Trevin, JM et al. Xmipp 3.0: een verbeterde softwaresuite voor beeldverwerking in elektronenmicroscopie. J. Structuur. Biol. 184 , 321-328 (2013).Artikel PubMed Google geleerde 
  53. Pettersen, EF et al. UCSF Chimera – een visualisatiesysteem voor verkennend onderzoek en analyse. J Comp. Chem. 25 , 1605-1612 (2004).Artikel CAS Google geleerde 
  54. Pettersen, EF et al. UCSF ChimeraX: structuurvisualisatie voor onderzoekers, docenten en ontwikkelaars. Eiwit Wetenschap. 30 , 70-82 (2021).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  55. Casañal, A., Lohkamp, ​​B. & Emsley, P. Huidige ontwikkelingen in Coot voor macromoleculaire modelbouw van elektronencryomicroscopie en kristallografische gegevens. Eiwit Wetenschap. 29 , 1069-1078 (2020).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  56. Burnley, T., Palmer, CM & Winn, M. Recente ontwikkelingen in de CCP-EM-softwaresuite. Acta Crystallogr. D-structuur. Biol. 73 , 469-477 (2017).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  57. Vagin, AA et al. REFMAC5-woordenboek: organisatie van voorafgaande chemische kennis en richtlijnen voor het gebruik ervan. Acta Crystallogr. D Biol. kristallogr. 60 , 2184-2195 (2004).Artikel PubMed Google geleerde 
  58. Adams, PD et al. PHENIX: een uitgebreid op Python gebaseerd systeem voor macromoleculaire structuuroplossingen. Acta Crystallogr. D Biol. kristallogr. 66 , 213-221 (2010).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  59. Schuck, P. Grootteverdelingsanalyse van macromoleculen door sedimentatiesnelheid ultracentrifugatie en Lamm-vergelijkingsmodellering. Biophys. J. 78 , 1606-1619 (2000).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  60. Brautigam, CA Berekeningen en illustraties van publicatiekwaliteit voor analytische ultracentrifugatiegegevens. Methoden Enzymol. 562 , 109-133 (2015).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  61. Laue, TM, Shah, B., Ridgeway, TM & Pelletier, SL in Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science (eds SE Harding, SE et al.) 90-125 (Royal Society of Chemistry, 1992).
  62. Kaczmarczyk, A., Brouwer, TB, Pham, C., Dekker, NH & van Noort, J. Indringende chromatinestructuur met magnetische pincet. Werkwijze Mol. Biol. 1814 , 297-323 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  63. Brouwer, TB, Kaczmarczyk, A., Pham, C. & van Noort, J. Ontrafelen van de DNA-organisatie met krachtspectroscopie op één molecuul met behulp van een magnetisch pincet. Werkwijze Mol. Biol. 1837 , 317-349 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  64. Meng, H., Andresen, K. & van Noort, J. Kwantitatieve analyse van krachtspectroscopie op één molecuul op gevouwen chromatinevezels. Nucleïnezuren Res. 43 , 3578-3590 (2015).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  65. Brouwer, TB, Hermans, N. & van Noort, J. Multiplexed nanometrische 3D-tracking van microbeads met behulp van een FFT-phasor-algoritme. Biophys. J. 118 , 2245-2257 (2020).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  66. Kaczmarczyk, A. et al. Krachtspectroscopie met één molecuul op histon H4-staart verknoopt chromatine onthult vezelvouwing. J. Biol. Chem. 292 , 17506-17513 (2017).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
  67. Evans, E. Onderzoek naar de relatie tussen kracht – levensduur – en chemie in enkelvoudige moleculaire bindingen. Annu. Eerwaarde Biophys. Biomol. structuur. 30 , 105-128 (2001).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
  68. Brower-Toland, BD et al. Mechanische verstoring van individuele nucleosomen onthult een omkeerbare meertraps afgifte van DNA. Proc. Natl Acad. Wetenschap. VS 99 , 1960-1965 (2002).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 

Referenties downloaden

Dankbetuigingen

We danken het personeel van het NTU Institute of Structural Biology (NISB), Nanyang Technological University, voor het verlenen van toegang tot faciliteiten; personeel van de Faciliteit voor Analyse, Karakterisering, Testen en Simulatie, Nanyang Technological University, voor het gebruik van hun elektronenmicroscoop en A. Wong en E. Smith voor hulp bij het verzamelen van gegevens; personeel van de Cryo-Electron Microscopy Facility van het Centre for Bioimaging Science, Department of Biological Science, National University of Singapore, en J. Shi voor wetenschappelijke en technische assistentie; W. Shum voor hulp bij de voorbereiding van histon- en DNA-templateconstructies; en C. Davey en S. Sandin voor hun waardevolle discussies en suggesties.

Auteurs informatie

Aantekeningen van de auteur

  1. Soek Yi Wong Huidige adres: Department of Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS, Medical School, Singapore, Singapore
  2. Vinod K. Vogirala Huidig ​​adres: Electron Bio-Imaging Centre (eBIC), Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, VK
  3. Deze auteurs droegen in gelijke mate bij: Aghil Soman, Sook Yi Wong

Auteurs en affiliaties

  1. School voor Biologische Wetenschappen, Nanyang Technological University, Singapore, SingaporeAghil Soman, Sook Yi Wong, Nikolay Korolev, Wahyu Surya, Simon Lattmann, Vinod K. Vogirala, Qinming Chen, Nikolay V. Berezhnoy, John van Noort, Daniela Rhodes & Lars Nordenskiöld
  2. NTU Instituut voor Structurele Biologie, Nanyang Technological University, Singapore, SingaporeSimon Lattmann, Daniela Rhodes & Lars Nordenskiöld
  3. Singapore Centrum voor Milieuwetenschappen Engineering (SCELSE), Nanyang Technological University, Singapore, SingaporeNikolay V. Berezhnoy
  4. Huygens-Kamerlingh Onnes Laboratory, Leiden University, Leiden, The NetherlandsJohn van Noort
  5. Medical Research Council, Laboratorium voor Moleculaire Biologie, Cambridge, VKDaniela Rhodos

bijdragen

AS, SYW, DR en LN hebben de studie geconceptualiseerd en ontworpen. AS bereidde rasters voor, verzamelde en verwerkte de cryo-EM-gegevens, voerde modelbouw en verfijning uit, bereidde constructen en biochemische testen voor. SYW bereidde constructen voor en voerde EM- en AUC-SV-experimenten met negatieve kleuring uit. SYW, WS en SL ontwierpen en voerden klonerings- en constructpreparaten uit. SL bedacht en ontwierp het MCS. SYW, WS en QC hebben monsters voorbereid voor krachtspectroscopie. VKV bereidde roosters voor en verzamelde cryo-EM-gegevens. NVB en JvN bouwden de magnetische pincet en voerden metingen uit. NK en JvN voerden en analyseerden krachtspectroscopiemetingen uit. AS, SYW, DR en LN schreven de paper met de hulp en inbreng van alle auteurs. Alle auteurs hebben bijgedragen aan de interpretatie van de gegevens.

Overeenkomstige auteurs

Correspondentie met Daniela Rhodes of Lars Nordenskiöld .

Ethische verklaringen

Concurrerende belangen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Peer review

Informatie over collegiale toetsing

Nature bedankt Jan Lipfert en de andere, anonieme reviewer(s) voor hun bijdrage aan de peer review van dit werk. Peer reviewer-rapporten zijn beschikbaar.

Extra informatie

Noot van de uitgever Springer Nature blijft neutraal met betrekking tot jurisdictieclaims in gepubliceerde kaarten en institutionele voorkeuren.

Uitgebreide gegevenscijfers en tabellen

Uitgebreide gegevens Afb. 1 Constructieontwerp van de pTelo-constructies.

a, Plasmidekaart van het pTelo-1-construct van 2844 bp. De pTelo-1-vector bestaat uit een menselijk telomeer DNA-insert van 151 bp geflankeerd door twee MCS (5′-MCS en 3′-MCS). De verschillende restrictieplaatsen die in de MCS’s zijn ingebed, maken verschillende manipulaties en modificaties van de telomerische insert mogelijk. Digestie met EcoRI en HindIII maakt de uitsteeksels van de telomere inzetstukken vrij die kunnen worden geligeerd aan asymmetrische handgrepen, zoals die worden gebruikt voor MMT-metingen in dit onderzoek. De twee EcoRV-sites maken het vrijgeven van het telomere inzetstuk met stompe uiteinden mogelijk voor nucleosoomreconstitutie en de productie van langere arrays. BbsI en BtgZI zijn type IIS-restrictie-enzymen die het construct splitsen binnen de 5′- en 3′-AvaI-plaatsen.bDe elementaire eenheid van de telomere DNA-template die in deze studie wordt gebruikt, bestaat uit een menselijk telomeerfragment van 151 bp (groen) geflankeerd door AvaI-restrictieplaatsen (rood) aan elk uiteinde. Eenmaal gemultimeriseerd, bestaan ​​de resulterende arrays uit integrale veelvouden van eenheden van 157 bp. De telomere eenheden van 157 bp worden vrijgegeven uit het pTelo-1-construct na AvaI-digestie en vervolgens gemultimeriseerd (1) tot een array door ligatie. De niet-palindromische aard van de AvaI-overhangen zorgt voor controle over de strengoriëntatie en voorkomt dat de G-rijke en C-rijke strengen zich vermengen. De resulterende multimeren bestaan ​​uit integrale veelvouden van eenheden van 157 bp, en de vereiste multimeergrootte wordt verkregen door koloniescreening in combinatie met restrictiedigestie-analyse. (2) Het hele proces kan worden versneld door multimeren aan elkaar te ligeren (bijv. 3×157-bp herhalingsfragmenten in 6×, 9× of 12× herhalingen). De afgifte van telomere arrays van 157 bp met AvaI-uitsteeksels aan elk uiteinde wordt bereikt door het plasmide te knippen met BbsI en BtgZI. Het resulterende insert wordt vervolgens geligeerd in integrale multimeren van de parentale array.cAls alternatief kan een reeds bestaande array eenzijdig worden uitgebreid door de vector selectief te openen op de stroomopwaartse of stroomafwaartse AvaI-site en een extra telomere array in te voegen. Deze benadering maakt het mogelijk de array voor onbepaalde tijd uit te breiden in een gecontroleerd en stapsgewijs proces. Evenzo kunnen hybride arrays met niet-telomere terminale sequenties (bijv. 601 Widom of alfa-satelliet DNA-sequenties) worden verkregen met dezelfde strategie. De array-uitbreidingsprocedure wordt beschreven in de sectie Materialen en methoden en wordt hierin geïllustreerd met pTelo-4-plasmide. (1) Ten eerste wordt pTelo-4 behandeld met BbsI en alkalische fosfatase om een ​​gelineariseerde en gedefosforyleerde ontvangende vector met AvaI-overhangs te genereren. (2) Afzonderlijk wordt een Telo-4-array uitgesneden uit pTelo-4 door EcoRV-digestie.d , Grootschalige bereiding van lange telomere DNA-array-template. (1) Een telomeer DNA-array-template van 10 x 157 bp (Telo-10) wordt door EcoRV-digestie uit de pTelo-10-vector geknipt. Het resulterende gezuiverde DNA-fragment wordt gedigereerd met BtgZI (2) of BbsI (3) om complementaire AvaI-overhangen te genereren aan de stroomafwaartse en stroomopwaartse uiteinden. Vervolgens worden de resulterende reactieproducten geligeerd om een ​​20 x 157-bp telomeer DNA-array-template (Telo-20) op te leveren.

Uitgebreide gegevens Afb. 2 Bereiding van het telomere DNA en 601-20 DNA voor in-vitro nucleosoomarray-reconstitutie.

a , Schematisch diagram van verschillende 20-meer 157-bp DNA-array-sjablonen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Telo-20-DNA bestaat uit twintig herhalingen van een Telo-1-fragment van 157 bp. #Telo-18# DNA geeft een chimere array-template aan bestaande uit achttien herhalingen van 157-bp Telo-1-eenheid geflankeerd door één eenheid van 157-bp Widom 601-sequentie (blauw) aan elk uiteinde. 601-20 DNA vertegenwoordigt een matrixsjabloon gemaakt van twintig herhalingen van de Widom 601-sequentie van 157 bp. bpTelo-10 werd gedigereerd met EcoRV en AvaI voor kwaliteitsanalyse. De resulterende fragmenten werden gefractioneerd op 1,0% TBE-agarosegel. De kwaliteit van de geamplificeerde Telo-10 werd beoordeeld met EcoRV-digestie van het plasmide om mogelijk gerecombineerd telomerisch DNA te onthullen (baan 2). Aanvullende gedeeltelijke digestie met AvaI (baan 3) toonde het aantal telomere herhalingen dat het plasmide bevat. c , Equimolair mengsel van de BtgZI- en BbsI-gedigereerde Telo-10-fragmenten werd overnacht geligeerd en geanalyseerd op 0,7% TBE-agarosegel. Densitometrische analyse toonde aan dat het geligeerde mengsel 70-75% van het Telo-20-DNA bevatte. dEquimolair van BtgZI-gedigereerde #Telo-8- en BbsI-gedigereerde Telo-10#-fragmenten werden overnacht geligeerd en geanalyseerd op 0,7% TBE-agarosegel. Densitometrische analyse toonde aan dat het geligeerde mengsel 70-75% van het #Telo-18# DNA bevatte. e , Gezuiverd 601-20 DNA gedeeltelijk gedigereerd met AvaI om exact 20 herhalingen te onthullen geanalyseerd op 0,7% TBE-agarosegel. f , Telo-4 DNA-matrijs werd uit de vector vrijgegeven door EcoRV-digestie gevolgd door PEG-groottefractionering en ionenuitwisselingszuivering (baan 2). Deze matrijs werd gebruikt om een ​​DNA-matrijs te genereren die meerdere Telo-4-DNA bevatte door zelfligatie gemedieerd door T4-ligase en ondersteund door T4-polynucleotidekinase (baan 3). In g , h , i , j , l, m en n , de zwarte driehoek geeft de verhouding histonoctameer (HO)/DNA aan die de optimale verzadiging produceert . g en h , Telo-20 ( g ) en #Telo-18# ( g ) gereconstitueerd met recombinant humaan histon-octameertitratie geanalyseerd op 0,7% Tris-boraat-agarosegel en nagekleurd met SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain. i , 601-20 gereconstitueerd met recombinant humaan histon-octameertitratie, met pUC57-skeletfragment van 147 bp als concurrent-DNA. Gereconstitueerde arrays werden geanalyseerd op 0,7% Tris-boraat-agarosegel en nagekleurd met SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain. jwerd Telo-tetra gereconstitueerd met recombinant humaan histon-octameer in aanwezigheid van 145 bp telomeer DNA als concurrent-DNA om optimale verzadiging te bepalen. De verzadiging van de gereconstitueerde arrays werd beoordeeld door hun migratie op een 1,2% 0,25x TBE-agarosegel. k , Reconstitutie van zelf-geligeerde Telo-4-template om arrays te geven die veelvouden van de Telo-tetra-eenheden bevatten. l , Het 601-tetra-nucleosoom werd gereconstitueerd als een controle ter vergelijking met Telo-tetra. m , Reconstitutie van het telomere DNA met de natieve sequentie zonder AvaI-restrictieplaatsen. n , Het Telo-10-DNA werd gereconstitueerd met recombinant humaan histon-octameer in aanwezigheid van 145 bp telomerisch DNA als concurrent-DNA om de optimale verzadiging te bepalen o, De reconstitutie van Telo-tetra met C-terminaal afgeknotte H2A (1-122) (H2AAC) histon-octameer (baan 4). De telo-tetra met ΔH2A histon-octameer migreert naar ongeveer dezelfde afstand als de Telo-tetra op een 1,2% 0,25xTBE-agarosegel. p , SDS-gelanalyse van het menselijke histon-octameer dat in het onderzoek werd gebruikt. Menselijke histon-octameren werden gereconstitueerd met wildtype (WT) H2A (baan 1) of C-terminale afgeknotte H2A (1-122) H2AAC, baan 2]. Voor b – p werden alle experimenten minstens driemaal onafhankelijk herhaald met vergelijkbare resultaten.

Uitgebreide gegevens Afb. 3 Analytische ultracentrifugatie-sedimentatiesnelheid (AUC-SV), negatieve vlek EM en single-molecule magnetische pincetanalyse van telomere chromatinevezels.

a, AUC-SV-gegevens, genormaliseerd naar de maximale s-waarde van de sedimentatiecoëfficiëntverdeling, (c(s)). De verdeling voor Telo-20 (groen) heeft twee brede pieken, wat wijst op de aanwezigheid van de lange Telo-20 (39,4 S) en de kortere en niet-afgebonden Telo-10-arrays (29,6 S). De volledige breedte bij half maximum (FWHM) waarde van de hoofdpiek bij 39,4 S is 4,3 S. De brede hoofdpiek van Telo-20 weerspiegelt de heterogeniteit in nucleosoomaantal van de arrays van ensemble-gemiddelde metingen van vezels in oplossing. #Telo-18# (rood) toont drie overlappende pieken die de aanwezigheid weerspiegelen van #Telo-18# (39.2 S), niet-afgebonden Telo-10# (32.5 S) en #Telo-8 arrays (27.8 S). De FWHM-waarde van de hoofdpiek bij 39,2S is 2,5 S. De scherpere hoofdpiek voor #Telo-18# duidt op een hogere homogeniteit in vergelijking met Telo-20. De 601-20-gegevens (blauw) tonen een enkele piek bij 40,2 S,b , c , en d , Representatieve negatieve vlekelektronenmicroscopiemicrofoto’s van Telo-20 in 0,6 mM Mg 2+ ( b ), #Telo-18 # in 0,6 mM Mg 2+ ( c ) en 601-20 in 0,8 mM Mg2 + ( d ). Kaders tonen een vergroot beeld van geselecteerde arrays om de gestapelde kenmerken van de telomere arrays of de ladderopstelling van de 601-20-array te illustreren. Voor elke array in b – d werden ten minste 3 onafhankelijke EM-experimenten uitgevoerd met vergelijkbare resultaten. e, Cryo-EM-afbeeldingen van gereconstitueerde 601-157 tetranucleosoomarrays die zigzagverdichting tonen onder identieke omstandigheden (1 mg/ml nucleosoomarray, 20 mM kaliumcacodylaat (pH 6,0), 0,08 mM MgCl2 , 1 mM DTT) waarbij Telo-tetra in f toont zuilvormige verpakking. Het zigzag-arrangement wordt gemarkeerd met een rode pijl en rechts wordt een close-up weergegeven. Het 601-157 tetranucleosoom behield de zigzagconformatie in meer dan drie onafhankelijke experimenten met variërende Mg 2+ -concentraties, met > 3 waarnemingen van elke Mg 2+ -concentratie. Omdat de gegevens overeenkwamen met de zigzag-conformatie van eerdere waarnemingen, werden er geen biologische replica’s uitgevoerd voor b.v. f, Representatieve cryo-EM-microfoto van Telo-tetra. De oriëntatie van de geselecteerde deeltjes wordt weergegeven met blauwe (bovenaanzichten) en zwarte (zijaanzichten) vakken. Elke dataset werd verkregen uit afzonderlijke batches histon-octameer en DNA en bevatte> 4500 microfoto’s met vergelijkbare conformaties. g en h , representatieve gegevens van rek-reliëfkrachtspectroscopiemetingen van #Telo-18# ( g , rode driehoeken en lijnen) en 601-20 ( h , blauwe vierkanten en lijnen). Punten zijn experimentele gegevens; lijnen passen vezelrekgegevens aan het statistisch-mechanische model; stippellijnen tonen het uitrekken van het kale DNA berekend door het WLC-model. In elk paneel worden de door het model bepaalde parameters weergegeven ( N totaal, N gevouwen , k , ∆G 1 , en ∆G 2 ). Voor de #Telo18# en 601-20 arrays. i , getailleerde vezelstijfheid, gekenmerkt door de rekmodulus ( k ); #Telo18# – rood, gemiddelde 0,49, sd 0,18, n = 167, bereik 0,21-1,03; 601-20 – blauw, gemiddelde 0,53, sd 0,19, n = 319, bereik 0,20-1,12. Het verschil in vezelstijfheid tussen de #Telo18# en 601-20 arrays is marginaal statistisch significant (p = 0,034). j , Voorzien van vrije energieën ∆G 1 en ∆G 2 . ∆G 1: #Telo18# – gemiddelde 12,6, sd 4,0, n = 167, bereik 5,2-23,4; 601-20 – gemiddelde 13,6, sd 3,4, n = 319, bereik 6,3-22,8. ∆G 1 -waarden verschillen aanzienlijk voor de #Telo18#- en 601-20-arrays (paneel j links; p = 0,004). ∆G 2 : #Telo18# – gemiddelde 4,5, sd 1,8, n = 167, bereik 0,8-8,3; 601-20 – gemiddelde 4,6, sd 1,7, n = 319, bereik 0,7-8,8. ∆G 2 -waarden zijn vergelijkbaar (paneel j , rechts; p = 0,65). In ( i ) en ( j ) worden gegevens die voor elk spoor zijn berekend, weergegeven als kleine symbolen; gemiddelde waarden worden aangegeven in de grafieken, kaders tonen gemiddelde ± sd; snorharen geven het gegevensbereik van 10-90% aan. Een t-toets met twee steekproeven met gelijke variantie werd uitgevoerd voor gegevens inik en j . k en l , Telomere nucleosomen ontvouwen zich met lagere krachten dan 601 nucleosomen. Heatmaps die de afhankelijkheid tonen van breekkrachtgebeurtenissen, Frupt , van de snelheid van uitgeoefende kracht en de waarden van de d (de afstand tussen de gebonden toestand en de activeringsbarrièrepiek) en koff (de snelheidsconstante voor bindingsverbreking onder nul externe kracht) werden bepaald zoals beschreven in de sectie Methoden. De gegevens voor de #Telo18# ( k ) en 601-20 ( l ) arrays. Magenta (#Telo-18#) en blauwe (601-20) lijnen passen lineair bij de F – ruptuur in de 10 pN < Fbreuk < 30 pN bereik. Voor de #Telo-18# array verkregen we d  = 0,880 ± 0,036 nm en k off  = 0,0128 ± 0,0016 1/s (2102 van de in totaal 3120 punten werden gebruikt); voor de 601-20-array, d  = 0,919 ± 0,024 nm en k off  = 0,0077 ± 0,0007 1/s (4303 van in totaal 6256 punten waren inbegrepen).

Data bron

Uitgebreide gegevens Afb. 4 Cryo-EM-screening van telomere arrays met de natieve sequentie, H2A(AC) Telo-tetra- en Telo-10-vezels. Analyse van de zich herhalende structurele eenheid in telomere vezels.

a , Representatieve microfoto van een telomere reeks met de natieve sequentie die is gereconstitueerd uit een repetitieve TTAGGG-DNA-template van ongeveer 600 bp zonder intermitterende AvaI-plaatsen. De arrays geven de kolomconformatie weer (groene cirkel); sommige deeltjes bevinden zich in de open toestand met een hoek van ongeveer 90 ° vlak-vlak tussen de nucleosomen (rode cirkel). Gedetailleerde weergaven van geselecteerde deeltjes worden rechts (kolom) en eronder (open toestand) getoond. b , Representatieve microfoto van Telo-tetra-arrays gereconstitueerd uit een histon-octameer dat een afgeknotte H2A bevat zonder de zeven laatste aminozuren van de C-terminale staart [H2A (AC)]. De arrays vertonen verminderde verdichting in vergelijking met de wildtype H2A-arrays bij identieke omstandigheden (1 mg/ml arrays, 20 mM kaliumcacodylaat (pH 6,0), 0,08 mM MgCl2 ). De arrays die zijn gereconstitueerd met de H2A (AC) isovorm vormen minder compacte kolomachtige structuren dan het wildtype construct (vergrote weergaven onder de microfoto). c , Representatieve microfoto van een Telo-10-array die het naast elkaar bestaan ​​van compacte kolommen (zwarte pijl) en conformaties in open toestand aan beide uiteinden (groene pijlen) en in het midden (rode pijlen) van de vezel laat zien. Voor panelen a – c werden de waargenomen conformaties geverifieerd in meer dan drie onafhankelijke experimenten met variërende Mg 2+ -concentraties, met ongeveer 5 of meer waarnemingen voor elke Mg 2+ -concentratie. Omdat de gegevens overeenkwamen met de kolomvormige conformatie van eerdere waarnemingen, werden er geen biologische herhalingen uitgevoerd voor a– c . d , Verfijnde kaart van de Tri-NCP met zij- en bovenaanzicht van de EM-kaart en montage van de gemodelleerde structuur (midden). Het rechterpaneel toont de analyse van de stapelparameters in deze gemodelleerde Tri-NCP-structuur, wat suggereert dat de Di-NCP de zich herhalende structurele eenheid is. Relatieve oriëntaties van de NCP-1 versus NCP-2 vergeleken met NCP-2 versus NCP-3 zijn vergelijkbaar: NCP-NCP-afstanden zijn 57,4 en 56,4 Å; dyade-dyade-hoeken zijn 135 o en 131 o (rode driehoeken in figuur 2g van de hoofdtekst); vlak-vlak hoeken zijn 18 o en 17 o . Nucleosomen worden benaderd als vlakken met normale vectoren; dyade-assen worden weergegeven als pijlen in de vlakken.

Uitgebreide gegevens Fig. 5 Stroomschema van gegevensverwerking van Telo-tetra Dataset 1 en samenvoeging van Datasets 1 en 2.

Het stroomschema illustreert de gegevensverwerking die wordt gebruikt voor dataset 1 (boven) en het samenvoegen van datasets 1 en 2 (onder). De verwerking van dataset 2 gebeurde op dezelfde manier als voor dataset 1, behalve dat het oppikken van deeltjes werd uitgevoerd met behulp van een 3D-sjabloon van de Di-NCP uit dataset 1. De afzonderlijke Telo-tetra EM-kaarten verkregen uit beide datasets vertoonden ontbrekende hoekige keer bekeken. Daarom werden Datasets 1 en 2 samengevoegd (onder), gevolgd door RELION auto-picking. Het samenvoegen van datasets maakte het mogelijk om een ​​homogene set deeltjes (26.580) te krijgen met verbeterde hoekweergaven en een betere resolutie (8,1 Å) (Extended Data Fig. 7a, b ) in vergelijking met individuele datasets.

Uitgebreide gegevens Afb. 6 Stroomschema van gegevensverwerking van gegevensset 3 en het samenvoegen van gegevenssets 1, 2 en 3 voor de telomere Di-NCP.

De linkerkant toont de Di-NCP en de rechterkant toont de extractie van de Mono-NCP en open Di-NCP-kaarten. Het vak linksonder toont het samenvoegen van de drie Di-NCP-datasets, dataset 1 (4,9 Å), dataset 2 (4,5 Å) en dataset 3 (3,9 Å), om een ​​gecombineerde kaart met een resolutie van 4,5 Å te genereren. vak linksonder.

Uitgebreide gegevens Afb. 7 Resolutie en hoekverdeling van de Telo-tetra, Tri-NCP en Di-NCP.

Panelen a , c , e , g , i en k tonen gouden standaard FSC-curven voor de overeenkomstige substructuren van Telo-tetra met resolutie geschat op een FSC-drempel van 0,143. De gecorrigeerde, niet-gemaskeerde, gemaskeerde en fasegerandomiseerde curven zijn respectievelijk zwart, groen, blauw en rood gekleurd. a , De Telo-tetra-kaart werd verfijnd tot een resolutie van 8,1 Å (datasets 1 en 2). b , Hoekverdeling van deeltjes gebruikt voor verfijning toont ontbrekende weergave en oriëntatievoorkeur (Dataset 1 en 2). c , De Tri-NCP-dichtheidskaart werd bepaald tot een resolutie van 8 Å (Dataset 1). d, Hoekverdeling van deeltjes die worden gebruikt om de Tri-NCP-structuur te bepalen (Dataset 1). e , De Di-NCP (Dataset 2) werd verfijnd tot een resolutie van 4,5 Å. f , Hoekverdeling van weergaven van deeltjes gebruikt voor de Di-NCP-verfijning (Dataset 2). g , De Di-NCP van Dataset 3 gaf een resolutie van 3,9 Å voor de Di-NCP-dichtheidskaart. h , Hoekverdeling van deeltjes gebruikt voor het bouwen van de Di-NCP-kaart met een resolutie van 3,9 Å (Dataset 3). i , De Mono-NCP (Dataset 3) werd verfijnd tot een resolutie van 3,5 Å. j , Hoekverdeling van de Mono-NCP-deeltjes (Dataset 3). k , De open Di-NCP-structuur werd bepaald tot een resolutie van 4,5 Å (Dataset 3). ik, Hoekverdeling van de open Di-NCP (Dataset 3)

Data bron

Uitgebreide gegevens Afb. 8 Bijdrage van histonstaarten aan stabilisatie van de kolomstructuur van de telomere chromatinevezel.

a , AUC-SV-gegevens voor de Telo-tetra-arrays met intacte (WT) histonstaarten (rechts, Telo-tetra) en met de C-terminale afgeknotte H2A (links, Telo-tetra H2A (ΔC)) in de ongevouwen (0 mM Mg 2+ ) of gecompacteerde (in aanwezigheid van 1 mM Mg 2+ ) vormen. Bij afwezigheid van Mg 2+ (wat een verlengde parel-aan-een-streng-conformatie geeft), vertoont de s-waardeverdeling van beide Telo-tetra-vezels twee pieken. We identificeerden de piek bij de grotere en lagere s-waarden als tetrameren en onderverzadigde vezels (met drie of twee nucleosomen). Bij afwezigheid van Mg 2+ zijn de piekposities van deze twee vormen van de WT-arrays ongeveer 21 S en 17 S. Voor de H2A(AC) isovorm zijn deze s-waarden 21 S en 18 S. Mg 2+-geïnduceerde verdichting van de arrays verschuift deze pieken respectievelijk naar 25 S en 19 S voor de WT-vezels 14 ; en tot 23 S en 19 S voor de H2A(AC) isovorm. De minder uitgesproken toename van de s-waarde voor de hoofdpiek van de H2A(AC)-arrays (van 21S tot 23 S) in vergelijking met de WT (van 21 S tot 25 S) wordt verondersteld te wijten te zijn aan de verminderde verdichting van de H2A(AC)-array veroorzaakt door de afknotting van de H2A C-termini. Buffercondities voor de AUC-SV-analyse: 10 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5), 0,1 mM EDTA en met 1 mM MgCl2 waar aangegeven. b, De samengevoegde telomere Di-NCP-elektronendichtheidskaart die buisachtige elektronendichtheden toont die voorlopig zijn toegewezen aan de histonstaarten (H3 blauw, H4 groen, H2A geel en H2B rood). De H2B N-terminale staarten bezetten voornamelijk locaties tussen de twee DNA-superhelices van een enkele NCP. De rode pijlen geven de H2B αC-helix aan die zich tussen het DNA van twee gestapelde NCP’s bevindt. De kleine overbruggingsdichtheid tussen de twee DNA’s van de αH2B C-helices wordt gesuggereerd om DNA-DNA-afstoting te screenen zoals waargenomen in nucleosoomkristallen 27 . c , Oppervlaktemodel (links) en elektrostatische oppervlaktepotentiaal (rechts) weergave van de histon-octameerinterface in Telo-tetra die overeenkomt met de oriëntatie in b, rechter zijde. De histon-octameerinterface in deze oriëntatie wordt gemedieerd door de interactie van de C-terminale staart (Pro117-Lys129) en lus 2 (Arg71-Lys74) van H2A van aangrenzende NCP’s. De zure patch gevormd door H2A-H2B is niet betrokken bij het bemiddelen van stapeling en is begraven in het interieur tussen de twee gestapelde octameren (gestippelde magenta doos). dElke gestapelde histon-octameerinterface wordt gemedieerd door vier sets histon-histone-interacties: twee paar H2A C-terminale staart (Pro117-Lys129) en lus 2 (Arg71-Lys74) interacties en twee paar interacties tussen H3 en H4. De eiwit-eiwit stapelinteracties tussen de histon-octameren vormen een spiraalvormig verweven netwerk van eiwit-eiwit elektrostatische interactie langs de as van de Telo-tetra kolomstructuur. Een weergave van een globaal bolmodel van dit spiraalvormige netwerk wordt getoond met de histonen H2A (geel), H3 (blauw) en H4 (groen) weergegeven als bollen. H2B neemt niet deel aan histon-interacties en wordt niet afgebeeld

Data bron

Uitgebreide gegevens Fig. 9 Digesties van Telo-tetra en structurele analyse van de NRL in telomeer tetranucleosoom.

a, AvaI, MNase en DNase digestie van de Telo-tetra. Laan M is een DNA-merker; twee rijstroken gemarkeerd met “Ar” tonen Telo-tetra. De linker “Ar” (baan 2) toont Telo-tetra in buffer met laag zoutgehalte en de rechterbaan (baan 3) toont Telo-tetra in DNase-buffer. Lanen “AvaI”, “MN” en “DN” zijn respectievelijk vertering van de Telo-tetra door AvaI endonuclease, Micrococcal nuclease (MNase) en DNase I nuclease. De banden gemarkeerd met een zwarte asterisk in de “AvaI” -baan geven 1 × 157-, 2 × 157-, 3 × 157- en 4 × 157-producten van de AvaI-digestie aan. Zowel MNase als DNase verteren de array tot DNA-nucleosoomkernlengte (145-157 bp) zoals aangegeven door de gele sterretjes in de MN”- en “DN”-banen. MNase en DNase I kunnen ook verder verteren in de kern van het nucleosoom, zoals gezien door het uitstrijkje in de “MN” -baan en gemarkeerd door een rode asterisk in de “DN” -baan.b , DNase I-digestie van telomere en 601 NCP’s. Baan M geeft DNA-marker aan; De rijstroken “601D” en “TD” tonen respectievelijk de vertering van de 601- en Telo-mono NCP’s. De 601 NCP vertoont een prominente DNase I-resistente bandpiek bij 145 bp; het telomere mononucleosoom wordt verteerd tot kortere DNA-fragmenten met een eerste DNase I-resistente band op ongeveer 130 bp. Voor panelen a en b werden vergelijkbare waarnemingen gedaan in meer dan 3 onafhankelijke experimenten; hoewel verschillen in verteringssnelheid werden waargenomen bij onafhankelijke experimenten, was het algemene distributiepatroon van bandgroottes vergelijkbaar. c en d, De kolomstructuur van de Telo-tetra wordt gestabiliseerd door de histonstaarten, H2A-C (geel) en H3 (blauw). Het H2A C-terminale domein beschermt het DNA aan de grens van de histon-octameren gescheiden door ~ 157 bp DNA (getoond in cyaan), wat suggereert dat deze bescherming de oorzaak kan zijn van de waargenomen nuclease-resistente band bij 157 bp. De verlengde DNase-behandeling resulteert in de vertering van het aangrenzende DNA dat is gepositioneerd tussen het H2A C-terminale domein en de H3-helix (magenta), wat leidt tot het verschijnen van de ~ 130 bp nuclease-resistente band.

Uitgebreide gegevens Afb. 10 Open toestand van de telomere Di-NCP, Tri-NCP en Telo-Tetra- en vergelijking met archaeaal chromatine.

In de panelen d , e en f (rechts) zijn de histonen H3, H4, H2A en H2B respectievelijk blauw, groen, geel en rood gekleurd. a , Elektronendichtheidskaart met warmtekaart die de lokale resolutie van de telomere Di-NCP in de open conformatie weergeeft. b , Superpositie van de open toestand van de telomere Di-NCP (blauw) en de archaeale chromatine (groen) 32 . De twee structuren vertonen bijna identieke globale kenmerken met een kleine afwijking in de openingshoek. c, Links, elektronendichtheidskaart van de open toestand in de telomere Tri-NCP. De kaart is gereconstrueerd uit 11.086 deeltjes uit dataset 2. De deeltjes die zijn gebruikt voor de telomere open Tri-NCP-structuur zijn afkomstig van de 130.951 deeltjes die zijn weggegooid bij de Telo-tetra-gegevensverwerking. De deeltjes ondergingen meerdere ronden van 3D-classificatie om de open Tri-NCP-deeltjes te selecteren. Juist, de gemodelleerde atomaire structuur van de open conformatie van de telomere Tri-NCP passend bij de elektronendichtheidskaart. d , Links, elektronendichtheidskaart en gemodelleerde structuur (rechts) van de open conformatie in de Telo-tetra. De kaart is gereconstrueerd uit 5.305 deeltjes geselecteerd uit de 3D-classificatie van de 130.951 picks (Dataset 2). e , De zigzagstructuur van de 6×187 601 array (6hkt) 12. f . Links de representatieve structuur van de pakking van hogere orde in het kristal van het op histon gebaseerde chromatine in archaea (PDB-code 5T5K 33 ). Het DNA en eiwit worden weergegeven als respectievelijk witte en blauwe bolletjes. Rechts, ter vergelijking is de kolomstructuur van de Telo-tetra weergegeven.Uitgebreide gegevenstabel 1 Gegevensverzameling en verfijning van elektronendichtheidskaart van Telo-tetra en substructuren

Tafel op ware grootteUitgebreide gegevenstabel 2 Structuurverfijningsstatistieken van Telo-tetra en substructuren

Tafel op ware grootte

Aanvullende informatie

Aanvullende afbeelding 1

Niet-bijgesneden afbeeldingen gebruikt in de Extended Data . a – o , niet-bijgesneden gelafbeeldingen van uitgebreide gegevens Fig. 2b – p. p , niet-bijgesneden afbeelding van uitgebreide gegevens Fig. 3f. q , r , niet-bijgesneden gelafbeeldingen van uitgebreide gegevens Fig. 9a, b.

Samenvatting rapportage

Peer Review-bestand

Aanvullende video 1

Structuur van Telo-tetra. De video toont in 3D de rotatie van de elektronendichtheidskaart en de verfijnde gemodelleerde structuur van het telomere tetranucleosoom dat overeenkomt met figuur 2c en illustreert de kolomvormige vouwing.

Aanvullende video 2

Structuur van Telo Di-NCP. De video toont in 3D de rotatie van de elektronendichtheidskaart van de dinucleosoomeenheid binnen de Telo-tetra, verkregen uit dataset 3 bij 3,9 Å. De verfijnde gebouwde structuur illustreert de nauwe stapeling tussen nucleosomen en histoncontacten.

Aanvullende video 3

Structuur van open Telo Di-NCP. De video illustreert de open dinucleosoom-conformatie. De gebouwde verfijnde open structuur laat zien dat de zure plek is blootgesteld aan en toegankelijk is voor eiwitfactoren.

Data bron

Brongegevens Afb. 1

Brongegevens Afb. 2

Brongegevens Uitgebreide gegevens Afb. 3

Brongegevens Uitgebreide gegevens Afb. 7

Brongegevens Uitgebreide gegevens Afb. 8

Springer Nature of haar licentiegever heeft de exclusieve rechten op dit artikel krachtens een uitgaveovereenkomst met de auteur(s) of andere rechthebbende(n); zelfarchivering door de auteur van de geaccepteerde manuscriptversie van dit artikel wordt uitsluitend beheerst door de voorwaarden van een dergelijke publicatieovereenkomst en de toepasselijke wetgeving.


            

            

                        
            
            

                
                

                    
                    
                

            


            

                

                assignment_turned_in
                Registrations

                


                    
                    
                    
                    

                        
No Registration form is selected.
(Click on the star on form card to select)
                    


                    
                    

                        
Please login to view this page.
                    


                    
                    

                        
Please login to view this page.

                    


                    
                    

                        
Please login to view this page.