PI(18:1/18:1) is een van SCD1 afgeleide lipokine die stresssignalering beperkt

gepubliceerd:27 mei 2022

Maria Thürmer ,André Gollowitzer ,Helmut Pein ,Konstantin Neukirch ,Elif Gelmez ,Lorenz Waltl ,Natalie Wielsch ,René Winkler ,Konstantin Loser ,Julia Groter ,Madeleine Hotze ,Sonke Harder ,Annika Doding ,Martina Meßner ,Fabiana TroisiMaximiliaan Ardelt ,Hartmut Schlueter ,

Johanna Pacmayr Oscar Gutierrez-Gutierrez ,Karl Lenhard Rudolf, Kathrin Thedieck ,Ulrike Schulze-Späte ,Cristina Gonzalez-Estevez ,Christian Kosan ,Aleš Svatoš ,Marcel Kwiatkowski &Andreas Koeberle 

Natuurcommunicatie volume 13 , Artikelnummer:  2982 ( 2022 ) Citeer dit artikel

• 4501 Toegangen
• 2 citaten
• 122 Altmetrisch
• statistiekendetails

Dit artikel is bijgewerkt

Abstract

Cytotoxische stress activeert door stress geactiveerde kinasen, initieert adaptieve mechanismen, waaronder de Unfolded Protein Response (UPR) en autofagie, en induceert geprogrammeerde celdood. Vetzuuronverzadiging, gecontroleerd door stearoyl-CoA-desaturase (SCD)1, voorkomt cytotoxische stress, maar de mechanismen zijn diffuus. Hier laten we zien dat 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfo-(1′-myo-inositol) [PI(18:1/18:1)] is een van SCD1 afgeleid signaallipide, dat p38-mitogeen-geactiveerde proteïnekinase-activering remt, en UPR, endoplasmatisch reticulum, tegengaat -geassocieerde eiwitafbraak en apoptose, reguleert autofagie en handhaaft celmorfologie en proliferatie. SCD1-expressie en de cellulaire PI (18: 1/18: 1) -verhouding nemen af ​​tijdens het begin van celdood, waardoor eiwitfosfatase 2 A wordt onderdrukt en stresssignalering wordt verbeterd. Deze tegenregulatie is van toepassing op mechanistisch diverse doodsinducerende aandoeningen en wordt aangetroffen in meerdere cellijnen van mens en muis en weefsels van Scd1-defecte muizen. PI(18:1/18:1)-ratio’s weerspiegelen stresstolerantie bij het ontstaan ​​van tumoren, chemoresistentie, infectie, vetrijk dieet en immuunveroudering. Samen is PI(18:1/18:1) een lipokine die vetzuuronverzadiging koppelt aan stressreacties, en de uitputting roept stresssignalering op.

Invoering

Vetzuuronverzadiging verbindt het celmetabolisme met stresssignalering ^1 , 2 . Overtollige verzadigde vetzuren (SFA’s) veroorzaken lipotoxische stress, terwijl meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA’s) membranen gevoeliger maken voor oxidatieve schade ^3 , 4 . Cellen hebben tijdens de evolutie verschillende strategieën ontwikkeld om stress te voelen en zich aan te passen aan metabole uitdagingen, waaronder door stress geactiveerde proteïnekinasen ^5 , 6 , de ongevouwen eiwitrespons (UPR) ⁷ en autofagie ⁸ .

Door stress geactiveerde proteïnekinasen spelen een belangrijke rol bij ontsteking en celhomeostase, omdat ze proliferatie, overleving, metabolisme en differentiatie reguleren ⁵ . Door deel te nemen aan cytotoxische stresssignalering en stressadaptatie, bevorderen ze de persistentie of initiëren ze geprogrammeerde celdood ^5 , 6 . De stress-geactiveerde p38 mitogeen-geactiveerde proteïne kinase α (MAPK14, p38 MAPK) wordt alomtegenwoordig tot expressie gebracht en geactiveerd binnen een sequentiële kinase cascade ^{9 , 10 , 11} . Na fosforylering van Thr ¹⁸⁰ en Tyr ¹⁸²in de activeringslus fosforyleert p38 MAPK een groot aantal stroomafwaartse substraten, waaronder transcriptiefactoren, mitogene kinasen en pro-apoptotische factoren die stressreacties mediëren, maar ook betrokken zijn bij processen die geen verband houden met stress ^{5 , 6 , 10 , 12} . P38 MAPK vergemakkelijkt onder andere de inductie en progressie van apoptose ⁶ , induceert de UPR ^3 , 13 , remt autofagie ^14 , 15 , koppelt endoplasmatisch reticulum (ER) -stress aan chaperonne-gemedieerde autofagie ^16 , 17 en draagt ​​bij aan tumoroverleving en -resistentie ^5 , 18. p38 MAPK wordt geactiveerd door genotoxische, inflammatoire en metabole stress ^5 , 10 , zoals hoge concentraties SFA’s, die lipotoxische ER-stress induceren bij fysiologisch relevante concentraties ³ .

Stressbeschermende mechanismen zoals de UPR of autofagie, die parallel worden geactiveerd, slagen erin de organelfunctie te behouden of brengen geprogrammeerde celdood op gang. Ze induceren intrinsieke apoptose ^19 , 20 of, in het geval van selectieve autofagie, bevorderen bovendien ferroptose ²¹ , een recent beschreven necrotisch geprogrammeerde celdoodroute op basis van lipideperoxidatie ^{4 , 22 , 23} . Cytosolische componenten worden afgebroken in autofagie en de afbraakproducten worden gerecycled om de energie te leveren om stressbeschermende mechanismen in stand te houden ²⁰ , bijv. de omzetting van overtollige SFA’s in enkelvoudig onverzadigde vetzuren (MUFA’s) ^24 , 25. MUFA’s zijn minder efficiënt dan SFA’s bij het opwekken van stress(-adaptieve) reacties of gaan zelfs door SFA veroorzaakte effecten ^{tegen3 , 26} .

De SFA/MUFA-verhouding wordt beïnvloed door systemische parameters, zoals het dieet, en binnen de cel aangepast door alom tot expressie gebrachte stearoyl-CoA-desaturasen (SCD’s) die een Δ9- cis -dubbele binding introduceren in SFA-co-enzym A (CoA) ²⁷ . Remming van het iso-enzym SCD1 veroorzaakt een verschuiving van MUFA’s als belangrijke cellulaire vetzuren naar SFA’s en PUFA’s door cellulaire lipiden ^{3 , 24 , 28 , 29} . Bijgevolg worden ER-stress en apoptose geïnduceerd, de gevoeligheid voor ferroptose verhoogd en stress-adaptieve reacties geïnitieerd, waaronder de p38 MAPK-cascade, de UPR en autofagie ^{3 , 24 , 30 , 31}. ^SCD1 wordt onderzocht als farmacologisch doelwit bij stofwisselingsziekten, huidaandoeningen en kanker, en selectieve remmers van SCD1 worden momenteel ^{klinisch onderzocht32,33} . Hoewel tal van onderzoeken naar cellen, dieren en mensen verschillende biologische functies van SFA’s en MUFA’s beschrijven, is het begrip van de metabolieten en fysiologisch relevante moleculaire mechanismen waarmee vetzuuronverzadiging stresssignalering reguleert fragmentarisch ³ . De besproken mechanismen richten zich op specifieke receptoren ³⁴ , membraanankers ³⁵ , redoxeigenschappen ³⁰ en veranderingen in membraanstijfheid, vloeibaarheid, permeabiliteit of microdomeinstructuur ^36 , 37. Verschillende studies speculeerden over een rol van SCD1 in de biosynthese van MUFA-afgeleide bioactieve lipiden ³ .

Hier rapporteren we over de identificatie van 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfo-(1′-myo-inositol) [PI(18:1/18:1)] als van SCD1 afgeleid lipokine dat overleving en gaat cellulaire stressreacties tegen door te interfereren met door stress geactiveerde routes, dwz p38 MAPK-signalering, de UPR en autofagie. De daling van PI (18: 1/18: 1) -niveaus tijdens het begin van geprogrammeerde celdood verbetert p38 MAPK-stresssignalering over cytotoxische aandoeningen en cellijnen en wordt geassocieerd met weefselspecifieke stressreacties in Scd1 -defecte muizen. Kwantitatieve proteomica benadrukt de katalytische subeenheid van eiwitfosfatase 2 A (Ppp2ca) als SCD1/PI(18:1/18:1)-gereguleerd eiwit dat uitput tijdens cytotoxische celstress en deelneemt aan p38 ^{MAPK38 , 39, 40} , UPR ⁴¹ , en autofagieregulatie ⁴² . We laten verder zien dat PI (18: 1/18: 1) -niveaus reageren op fysiologische stressomstandigheden, waaronder tumorigenese, chemoresistentie, infectie, dieetbeperkingen en veroudering, en schetsen voorbeelden van verbanden met stress (-adaptieve) signalering.

Resultaten

MUFA’s in PI raken uitgeput tijdens geprogrammeerde celdood

We hebben geprogrammeerde celdood in fibroblasten geïnduceerd door omstandigheden die een breed mechanistisch bereik bestrijken. Celdood werd veroorzaakt door (i) remming van pan-kinase (staurosporine, STS) ⁴³ , (ii) de blokkering van eiwitbiosynthese (cycloheximide, CHX) ⁴⁴ , (iii) inactivatie van topoisomerase die leidt tot DNA-strengbreuken (etoposide, ETO) ⁴⁵ , (iv) de verstoring van K ⁺ -gradiënten (valinomycine, VAL) ⁴⁶ , (v) ER-stressinductie door uitputting van ER Ca2 ⁺ -voorraden (thapsigargin, TPG) ⁴⁷ , (vi) interferentie met de mitochondriale functie door zich te richten op warmte- schokproteïne 60 (myrtucommulone A, MC) ⁴⁸(vii) stopzetting van de celcyclus na remming van cycline-afhankelijke kinasen en glycogeensynthasekinase-3β (indirubine-3′-monoxim, I3M) ^49 , 50 , en (viii) het onttrekken van voedingsstoffen en groeifactoren door serumdepletie. Bovendien werden fibroblasten gesensibiliseerd voor cytotoxische stress door tumornecrosefactor (TNF)a zonder per se apoptose te ^induceren51 .

We volgden de fosfolipidensamenstelling van nog steeds aangehechte (levensvatbare) fibroblasten onder deze cytotoxische omstandigheden gedurende 48 uur en combineerden de gegevens in een co-gereguleerd fosfolipidennetwerk (aanvullende figuur  1a ). Positief gecorreleerde fosfolipiden bevinden zich dicht bij elkaar en zijn met elkaar verbonden, terwijl niet- of tegengereguleerde fosfolipiden afzonderlijke clusters vormen. Onze focus werd gelegd op het cluster linksonder, dat wordt gedomineerd door fosfatidylcholines (PC), fosfatidylethanolamines (PE), fosfatidylserines (PS) en PI-soorten die een of twee MUFA’s bevatten (aanvullende figuur  1a ).

Het cellulaire aandeel van fosfolipidensoorten die MUFA’s bevatten, dwz palmitoleïnezuur (16:1) of oliezuur (18:1), was aanzienlijk verminderd door verschillende cytotoxische instellingen (dwz STS, CHX, ETO, TPG, VAL, serumdepletie, en marginaal MC) na 6-48 uur (aanvullende figuur  1b ), met de sterkste effecten op PI’s (figuur  1a ). Kinetische gegevens over totale PI- en MUFA-PI-niveaus worden getoond in figuur  1b en aanvullende figuur  1c . PI’s die twee MUFA’s bevatten, werden nog consistenter neerwaarts gereguleerd in geprogrammeerde celdood dan soorten die 18:1 combineren met SFA’s of PUFA’s. Aldus waren PI (16: 1/18: 1) en PI (18: 1/18: 1) aanzienlijk verminderd voor alle bestudeerde cytotoxische stimuli (Fig.  1a, c , Aanvullende Fig.  1d), inclusief I3M en MC, die de MUFA-ratio in PI niet konden verlagen (figuur  1a ). MUFA’s in andere fosfolipidenklassen werden minder aangetast, en alleen CHX, TPG en VAL verlaagden de MUFA-verhouding van PC, PE of PS aanzienlijk (Fig.  1d-f en Aanvullende Fig.  1e, f ).

De afname van MUFA-bevattende PI-soorten (MUFA-PI’s) ging gepaard met een groter aandeel soorten met PUFA’s, dwz eicosatrieenzuur (20:3), arachidonzuur (20:4), docosapentaeenzuur (22:5), en docosahexaeenzuur (22:6) (fig.  1c ). Aangezien de totale PI-niveaus niet substantieel worden opgereguleerd onder cytotoxische omstandigheden (Fig.  1b ), weerspiegelt de relatieve verrijking van PUFA-bevattende PI’s een toename in absolute aantallen. Lipidomische analyse suggereert dat PUFA’s en MUFA’s worden herverdeeld tijdens het begin van celdood. Aldus zijn PI(palmitinezuur (16:0)/18:1), PI(16:1/18:1) en PI(18:1/18:1) verrijkt voor meerdere cytotoxische stressoren 6 uur na celdood inductie voordat de uitputting van MUFA’s overheerst (Fig.  1c ).

Cytotoxische daling van MUFA-PI correleert met actieve p38 MAPK

We hebben onderzocht of door de dood veroorzaakte veranderingen in het fosfolipidenprofiel geassocieerd zijn met de regulatie van door stress geactiveerde kinasen. In het bijzonder vertoonden fosfolipiden van het MUFA-rijke cluster een negatieve correlatie met p38 MAPK-fosforylering (Fig.  2a ) in overeenstemming met eerdere studies die zich bezighielden met ER-stress en M/G1-overgang in de celcyclus ²⁹ . p38 MAPK werd snel geactiveerd binnen 10 minuten tot 6 uur en ervoer daarna een nog sterkere boost in activering tot 48 uur (Fig.  2b, c ). Deze tweede fase van p38 MAPK-fosforylering heeft een vergelijkbare kinetiek als de afname van de cellulaire MUFA-PI-verhoudingen (figuur  1c en aanvullende figuur  1b, c). Beide effecten manifesteerden zich tussen 6 en 48 uur behandeling en werden tijdsafhankelijk versterkt. Aangezien STS een pan-kinaseremmer is ⁴³ , hebben we het effect ervan op kinasefosforylering niet verder overwogen, hoewel p-p38 MAPK-niveaus verhoogd waren zoals verwacht. Substantiële activering van JNK, een ander belangrijk door stress geactiveerd kinase, was alleen duidelijk voor TPG en MC (Fig.  2d ), wat suggereert dat de globale negatieve correlatie van MUFA-PI p38 MAPK-specifiek is.

Om verder te onderzoeken of MUFA-PI-verhoudingen en p38 MAPK-activering correleren tijdens celdood in andere cellijnen, hebben we VAL geselecteerd, wat een representatieve, gemiddelde afname van MUFA-PI-niveaus in NIH-3T3-fibroblasten veroorzaakte (figuur  1a ). De negatieve co-regulatie van PI (18: 1/18: 1) en p38 MAPK is niet beperkt tot apoptotische fibroblasten, maar werd ook gevonden in menselijke MCF-7-borstkanker en menselijke HepG2-hepatocarcinoomcellen (Fig.  2e). Bovendien zagen we trends naar lagere PI (18: 1/18: 1) -verhoudingen en verhoogde p38 MAPK-activering voor met VAL behandelde menselijke HEK-293-embryonale niercellen en primaire menselijke monocyten. Aan de andere kant verminderde VAL niet substantieel het aandeel van PI (18:1/18:1) noch verhoogde p38 MAPK-fosforylering in menselijke MM6 monocytische cellen, menselijke HT-29 colon adenocarcinoomcellen en menselijke HeLa cervixcarcinoomcellen, en beide parameters waren verlaagd in menselijke navelstrengendotheelcellen (HUVEC’s) (Fig.  2e ). Deze heterogeniteit is niet verrassend in het licht van het experimentele ontwerp (aanvullende opmerking  1 ) en de variabele connectiviteit van het p38 MAPK-signaleringsnetwerk voor verschillende celtypen ^{5 , 6 , 9 , 10}. Samen neemt het cellulaire aandeel van PI(18:1/18:1) af in (pre)apoptotische cellen voor verschillende cytotoxische mechanismen, en de uitputting van dit lipide gaat gepaard met de inductie van p38 MAPK-stresssignalering over diverse cellijnen.

MUFA-uitputting en cytotoxische stress als gevolg van SCD1-repressie

Om te verduidelijken hoe celdood MUFA-PI-niveaus verlaagt, hebben we eerst onderzocht of de beschikbaarheid van niet-veresterde MUFA’s en lyso-PI (LPI) wordt beïnvloed door cytotoxische stress in fibroblasten. Hoofdcomponentanalyse toont aan dat de MUFA’s 16: 1 en 18: 1, gelegen in het kwadrant linksonder, afzonderlijk worden gereguleerd van het grootste deel van de vetzuren die zijn geclusterd in het kwadrant rechtsonder (aanvullende figuur  3a ). Het aandeel vrije MUFA’s nam aanzienlijk af tijdens de cytotoxische instellingen, terwijl de verhouding van SFA’s toenam (Fig.  3a-c , Aanvullende Fig.  3b ), behalve I3M, die het aandeel vrij (Fig.  3a ) noch PI aanzienlijk verlaagde. -gebonden MUFA’s (Fig.  1a). Lyso PI (LPI) -soorten (16: 0-LPI, 18: 0-LPI, 18: 1-LPI) werden in plaats daarvan differentieel gereguleerd onder de vier onderzochte cytotoxische instellingen (aanvullende figuur  3c ). Hoewel TPG en serumdepletie en, trendmatig, MC het aandeel van verschillende LPI-soorten verhoogde, had VAL geen invloed op cellulaire LPI-verhoudingen, en geen van de cytotoxische stressoren vertoonde een voorkeur voor 18:1-LPI, de fosfolipase A ₂ (PLA ₂ ) splitsingsproduct van PI(18:1/18:1). Onze gegevens geven dus aan dat de MUFA-biosynthese wordt verminderd door cytotoxische stress en eerder (MUFA-selectieve) PI-afbraak door fosfolipases als dominant mechanisme voor de uitputting van PI (18:1/18:1) uitsluit.

De de novo biosynthese van SFA’s en MUFA’s hangt af van de gezamenlijke werking van acetyl-CoA-carboxylase (ACC) en vetzuursynthase (FAS). Selectieve remming van ACC met soraphen A of siRNA verminderde noch het aandeel van fosfolipide-gebonden MUFA’s, noch induceerde p38 MAPK-signalering (aanvullende figuur  4 en aanvullende opmerking  3 ).

De balans tussen SFA’s en MUFA’s wordt aangepast door Δ9-desaturasen , waarbij SCD1 onderhevig is aan intensieve transcriptionele regulatie3 ^, 24 . In feite verlaagden veel cytotoxische middelen de Scd1- mRNA-niveaus aanzienlijk tussen 6 en 48 uur (Fig.  3d en Aanvullende Fig.  5 ) en SCD1-eiwitexpressie na 48 uur (Fig.  3e ). Uitzonderingen zijn I3M, die ook de vrije MUFA (Fig.  3a ) en MUFA-PI-verhoudingen (Fig.  1a ) niet kon verminderen, en STS, die zowel vrije (Fig.  3a ) als veresterde  MUFA’s (Fig. 1a ) verlaagt.) via een SCD1-onafhankelijk mechanisme. Aangezien MUFA’s worden geproduceerd door SCD1 en in fosfolipiden worden opgenomen als CoA-esters ³ , waren we verrast dat MUFA-CoA-niveaus werden gehandhaafd tijdens de initiatie van geprogrammeerde celdood (aanvullende figuur  6 ), wat suggereert dat MUFA’s uit andere bronnen dan SCD1 compenseren het cytotoxische verlies van MUFA-CoA’s en worden slecht gekanaliseerd in PI-biosynthese.

De rol van SCD1 in fibroblasthomeostase en stresssignalering werd onderzocht met behulp van de selectieve SCD1-remmer CAY10566 en door tijdelijke knockdown. CAY10566 (i) verbeterde p38 MAPK-fosforylering (Fig.  4a ) ter bevestiging van onze eerdere studie ²⁹ , (ii) verschoof de acyl-CoA-verhouding van MUFA’s naar SFA’s (Fig.  4b ), en (iii) verminderde het cellulaire aandeel van MUFA -PI en PI (18: 1/18: 1) in plaats van MUFA-PC (figuur  4c , aanvullende figuur  7 , aanvullende figuur  8a ) zonder de absolute hoeveelheid PI substantieel te verminderen (aanvullende figuur  8b ). Vergelijkbare effecten werden waargenomen toen Scd1 tot zwijgen werd gebracht door siRNA (Fig.  4d, e). Knockdown-efficiënties van siRNA’s op mRNA- en eiwitniveaus worden getoond in Aanvullende Fig.  9a, b .

Belangrijke kinasen die p38 MAPK activeren zijn de MAPK-kinase (MKK)3 en MKK6 ^{en minder MKK45,6} . SCD1-remming door CAY10566 induceerde MKK3 / 6-fosforylering met vergelijkbare kinetiek als p38 MAPK (aanvullende figuur  10a, b ), terwijl MKK4 niet was geactiveerd (aanvullende figuur  10c ). Vervolgens onderzochten we vermeende MAPK-kinases-kinases (MAP3K) die MKK3 / 6 zouden kunnen fosforyleren en identificeerden we mixed lineage kinase (MLK) 3 om te worden geactiveerd na behandeling met CAY10566 (aanvullende figuur  10d ).

Markers van ER-stress (bindend eiwit, BiP) (figuur  4f en aanvullende figuur  11a ), autofagie (lichte keten (LC) 3B II) (figuur  4g ) en apoptose (gesplitst PARP, figuur  4h ; PS-externalisatie, Fig.  4i en aanvullende Fig.  11b ) waren substantieel opgereguleerd in met CAY10566 behandelde fibroblasten, zoals verwacht uit Scd1- knockout-onderzoeken ^3 , 24 . Fibroblasten kregen een uitgerekte, spoelvormige morfologie (figuur  4j ) met dezelfde diameter als controlecellen (aanvullende figuur  11c ), en het aantal cellen was matig verminderd (figuur  4k ).) zonder dat de integriteit van het celmembraan wordt aangetast (aanvullende figuur  11d ). _{Met name waren PI-afgeleide fosfoinositiden (PIP’s) niet verlaagd maar eerder verhoogd, zoals voorbeeldig getoond voor fosfatidylinsositol-3,4,5 –} trifosfaat (PIP3 ) (Fig.  4l ).

Omdat tyrosinekinasen een centrale rol spelen bij de regulatie van de bovengenoemde cellulaire processen, immunoprecipiteerden we fosfo-tyrosine-eiwitten, scheidden ze door SDS-gelelektroforese (aanvullende figuur  12a ) en identificeerden we eiwitten in differentieel gereguleerde banden door kwantitatieve proteomics ( aanvullende figuur 12a). Afb.  12b , aanvullende gegevens  1 ). Interessant is dat een van de treffers, lysosomale groep XV fosfolipase A ₂ (LPLA ₂ ), (i) wordt geactiveerd door negatief geladen fosfolipiden, zoals PI, (ii) specificiteit vertoont voor glycerofosfolipiden met onverzadigde vetzuren, waaronder 18:1, beide in sn −1 en sn-2-positie, en (iii) transacyleert ceramiden met korte keten, die proliferatie belemmeren, de ER-functie verstoren en celdood versterken ⁵² . Samen laten we zien dat geprogrammeerde celdood (i) SCD1-expressie remt, (ii) MUFA-PI-verhoudingen verlaagt en (iii) p38 MAPK-stresssignalering induceert, en we tonen aan dat SCD1 deelneemt aan MUFA-PI-biosynthese en p38 MAPK-activering.

Door eerst SCD1 in fibroblasten te blokkeren met behulp van CAY10566 en vervolgens de cellen onder verschillende cytotoxische omstandigheden te kweken, bevestigden we een functionele link tussen de vroege cytotoxische daling in SCD1 (dwz voordat geprogrammeerde celdood substantieel wordt uitgevoerd) en de hierboven beschreven fenotypes (aanvullende figuren 13 en 14 , aanvullende aantekening  4 ) . Bovendien hebben we uitgesloten dat p38 MAPK SCD1-afhankelijke veranderingen in de fosfolipidensamenstelling medieert (aanvullende figuur  15 , aanvullende opmerking  5 ) en hebben we aangetoond dat de vroege cytotoxische afname van SCD1 onafhankelijk is van caspasen (aanvullende figuur  16 , aanvullende opmerking  6 ).

MUFA-bevattende PI voorspelt stress bij Scd1 -defecte muizen

Muizen die homozygoot zijn voor het Scd1 ^ab-2J allel hebben een defect Scd1 gen met een in-frame stopcodon in exon ²⁵³ . Om SCD1-afgeleide fosfolipidensoorten te identificeren die omgekeerd gereguleerd zijn voor stresssignalering in vivo, hebben we ons gericht op organen en weefsels die SCD1 sterk tot expressie brengen en die worden beschouwd als doelwitten voor interventie met SCD1-remmers, dwz lever, huid, skeletspier van de achterpoten en wit buikvet ²⁴ . Markereiwitten van ER-stress / UPR en autofagie waren aanzienlijk verhoogd in Scd1 -defecte muizen. Terwijl lever en vet beide stress-adaptieve routes aangaan, wordt alleen ER-stress / UPR geactiveerd in de skeletspier en geen van beide wordt geïnduceerd in de huid (Fig.  5a , Aanvullende Fig. 17 ). Dienovereenkomstig waren de niveaus van gefosforyleerd p38 MAPK (Thr180 / Tyr182) aanzienlijk hoger in de lever van Scd1 ^ab-2J dan wildtype muizen, wat we gedeeltelijk toeschrijven aan een opwaartse regulatie van totaal p38 MAPK (Fig.  5a ).

De totale hoeveelheden fosfolipiden werden verlaagd door Scd1- inactivatie in de spieren, niet aangetast in de lever, en verhoogd in vet en minder in de huid (aanvullende figuur  18a ). Deze weefselspecifieke verschillen hangen waarschijnlijk af van de preferentiële afname van neutrale lipiden ⁵³ en de daaruit voortvloeiende toename van het aandeel fosfolipiden ten opzichte van de weefselmassa. Meer consistent is de verwachte daling van MUFA-bevattende fosfolipiden in Scd1 ^ab-2J- muizen (figuur  5b , aanvullende figuur  18b ). Onder de soorten die het sterkst zijn en het sterkst zijn afgenomen, zijn fosfolipiden die twee MUFA’s dragen, dwz combinaties van 18: 1/18: 1 en 16: 1/18: 1 (Fig.  5c – e en Aanvullende Fig. 18c, d ). Hoofdcomponentanalyse groepeert deze fosfolipiden in een dichte cluster samen met specifieke MUFA-bevattende PC- en PI-soorten (aanvullende figuur  18e ). Het cellulaire aandeel van deze geclusterde fosfolipiden neemt af in weefsels van Scd1 ^ab-2J muizen ten opzichte van PC- en PI-soorten die SFA’s en PUFA’s bevatten, zoals PI(18:0/22:5n-3), PC(18:0/22 :5), PC(18:0/22:6) en PC(18:0/linolzuur (18:2)), die aanzienlijk opgereguleerd zijn.

PI (18: 1/18: 1) wordt bij voorkeur verminderd in lever en vet (figuur  5c ), de twee weefsels die het meest gevoelig reageerden op de inductie van door stress gereguleerde routes (figuur  5a en aanvullende figuur  17 ). Een vergelijkbaar patroon werd waargenomen voor PI(18:1/18:2), PI(16:0/18:1), PI(18:1/20:3n-6), PI(18:1/20:4 ) (Fig.  5c ) en verschillende pc-soorten zoals pc (16: 1/18: 1), pc (18: 1/18: 1), pc (16: 0/16: 1) en pc (18: 1/20:3) (aanvullende figuur  18c ). Samen wordt Scd1- inactivatie geassocieerd met ernstige veranderingen in de hoeveelheid fosfolipiden en de vetzuursamenstelling, maar slechts een beperkt aantal soorten, zoals PI (18: 1/18: 1), voorspellen stressreacties in weefsels.

SCD1-afgeleide PI (18:1/18:1) beperkt stresssignalering

De moleculaire mechanismen die SCD1-activiteit vertalen in biologische reacties zijn slecht begrepen ³ . Om te onderzoeken of van SCD1 afgeleide fosfolipiden stresssignalering tegengaan en om de betrokken signaleringslipiden te identificeren, remden we SCD1 in fibroblasten door CAY10566 en namen we vervolgens gedefinieerde fosfolipidensoorten op. We concentreerden ons op de meest voorkomende PC- en PI-soorten die werden gereguleerd in apoptotische fibroblasten (aanvullende figuur  19 ) en muizen die defect waren in Scd1 (aanvullende figuur  18e ).), dwz de van SCD1 afgeleide fosfolipiden PC(18:1/18:1) en PI(18:1/18:1) met twee enkelvoudig onverzadigde acylketens, PC(16:0/18:1) met verzadigd/enkelvoudig onverzadigde acylketens en PI(stearinezuur (18:0)/20:4) met verzadigde/meervoudig onverzadigde acylketens. Deze set werd aangevuld met de verzadigde fosfolipiden PC(16:0/16:0) en PI(16:0/16:0) die als controle werden gebruikt.

Alle fosfolipiden werden binnen 48 uur efficiënt opgenomen door fibroblasten wanneer ze werden geleverd als liposomen (aanvullende figuur  20a ), maar alleen PI (18: 1/18: 1) (en ook niet de verzadigde controle-PI (16: 0/16: 0) noch pc-soorten) compenseerden efficiënt voor de blokkering van SCD1: PI (18: 1/18: 1) verhoogde cellulaire PI (18: 1/18: 1) niveaus boven de basislijn (aanvullend Fig.  20b ), verhinderde p38 MAPK-activering (Fig . .6a  ), verminderde ER-stress (Fig.  6b , c , Aanvullende Fig.  20c ), verminderde PARP-splitsing (Fig.  6d ), verminderde de verhouding van late tot vroege apoptotische cellen, indicatief voor vertraagde apoptose (Fig.  6e ), en gedeeltelijk herstelde fibroblastmorfologie (Fig.  6fen aanvullende figuur  20d ) en celproliferatie in aanwezigheid van CAY10566 (figuur  6g ). Merk op dat de concentratie van gesupplementeerd PI(18:1/18:1) (50 µM) dicht bij de gemiddelde plasmaconcentraties ligt voor PI(18:1/18:1) en PI(16:1/18:1) in knaagdieren met ad libitum toegang tot voedsel ⁵⁴ .

Het compenserende effect van PI (18: 1/18: 1) op p38 MAPK-activering werd bevestigd door knockdown van SCD1 (Fig.  6h ). Als alternatief hebben we 18:1 aan het kweekmedium toegevoegd en cellen behandeld met CAY10566. Suppletie van 18: 1 voorkwam de afname van cellulaire MUFA-PI- en PI (18: 1/18: 1) -niveaus (aanvullende figuur  21a ) en verminderde stresssignalering (aanvullende figuur  21b ), vergelijkbaar effectief of zelfs superieur aan PI (18:1/18:1). Dit laatste is met name van toepassing op UPR-inductie in met CAY10566 behandelde fibroblasten, waarbij 18: 1 (aanvullende figuur  21b ) efficiënter was dan PI (18: 1/18: 1) bij het onderdrukken van BiP-expressie (figuur  6b ).). Suppletie van 16: 0 versterkte in plaats daarvan de cytotoxische activiteit van CAY10566 (aanvullende figuur  21c ). Samen onthult onze studie prominente stressonderdrukkende activiteiten voor PI(18:1/18:1), maar suggereert ook dat PI(18:1/18:1)-onafhankelijke mechanismen (mogelijk gerelateerd aan de verhoogde MUFA/SFA-ratio) aan de stressverminderende functie van SCD1.

Cellulaire opname en distributie van liposomale fosfolipiden is traag en gaat gepaard met hun endocytose en lysosomale afbraak ⁵⁵ . Om uit te sluiten dat PI(18:1/18:1) tijdens deze periode duidelijk MUFA’s afbreekt en afgeeft, hebben we de intracellulaire concentratie van niet-veresterde vetzuren gevolgd. Terwijl PI (18: 1/18: 1) zich sterk ophoopte in de cel binnen 48 uur na suppletie met fosfolipiden (aanvullende figuur  22a ), was vrij intracellulair 18: 1 niet opmerkelijk verhoogd (aanvullende figuur  22b ), wat verder onderstreept dat de fosfolipide en niet vrij 18:1 is het kritische signaalmolecuul dat de stressonderdrukkende eigenschappen van PI bemiddelt (18:1/18:1).

We gebruikten een alternatieve strategie voor de afgifte van lipiden op basis van fusogene liposomen om PI (18:1/18:1) onmiddellijk in cellen op te nemen. PI(18:1/18:1) werd efficiënt opgenomen door fibroblasten zoals verwacht (Fig.  7a ), maar de overmaat fosfolipide werd binnen 24 uur snel afgebroken tot de basislijn (Fig.  7b ). De voorbijgaande toename van PI (18: 1/18: 1) -verhoudingen (Fig.  7c ) blokkeerde niettemin de p38 MAPK-activering op lange termijn (Fig.  7d ), verminderde de LC3B-II / I-verhouding die indicatief is voor veranderde autofagie (Fig.  7e ), verminderde apoptotische PARP-splitsing (Fig.  7f ), en gedeeltelijk herstelde celmorfologie in met CAY10566 behandelde fibroblasten (Fig.  7g). Aan de andere kant was de enkele puls van PI (18:1/18:1) niet voldoende om ER-stress te voorkomen (Fig.  7h ) en het aantal cellen te herstellen (Fig.  7i ). PI(18:1/18:1) is dus een van SCD1 afgeleid lipokine, dat belangrijke stress-inductieve en stress-adaptieve reacties tegengaat, afhankelijk van de kinetiek van de vorming en afbraak van PI(18:1/18:1).

PI(18:1/18:1) biosynthese en stresssignalering

Om meer inzicht te krijgen in de mechanismen die bijdragen aan de uitputting van cytotoxische PI (18: 1/18: 1), hebben we het proteoom van met VAL en MC behandelde fibroblasten kwantitatief vergeleken (aanvullende figuur  23 , aanvullende gegevens  1 ). Gezien onze focus op overkoepelende cytotoxische mechanismen, hebben we alleen eiwitten overwogen die gelijktijdig worden gereguleerd door VAL en MC in dezelfde richting (aanvullende gegevens  2 ). Cytotoxische stress geïnduceerd door VAL en MC verlaagde de beschikbaarheid van CTP-synthase (Ctps)2 en verschoof de balans in de remodelleringsroute van PI-generatie (via lysofosfolipide-acyltransferase (Lplat)6/Lclat1) naar afbraak (via cytosolische fosfolipase A _2α (Pla2g4a) ) (Aanvullende afbeelding  24a-d). We hebben verder onderzocht of effecten op enzymen in de biosynthese en het metabolisme van PI worden nagebootst door de SCD1-remmer CAY10566 en of PI (18: 1/18.1) het verlies van SCD1-activiteit compenseert. CAY10566 activeerde de omschakeling in PI-remodellering (aanvullend Fig.  24a, e ), en suppletie van PI (18: 1/18: 1) verslechterde deze katabole verschuiving efficiënter dan de controle-PI (16: 0/16: 0) (aanvullend Afb.  24a, b, f ). Onze bevindingen geven dus aan dat PI-remodellering, althans gedeeltelijk, wordt georkestreerd door SCD1-afgeleide PI (18: 1/18: 1). Aangezien Lplat6 18:1-CoA accepteert samen met andere acyl-CoA’s ⁵⁶ terwijl Pla2g4a de voorkeur geeft aan PUFA-bevattende fosfolipiden ⁵⁷, is het moeilijk in te schatten of de tegenregulatie van de twee enzymen de depletie van PI(18:1/18:1) bevordert ten opzichte van andere PI-soorten. Merk op dat CAY10566 geen substantiële invloed had op de mRNA-niveaus van het terminale enzym in PI-biosynthese, fosfatidylinositolsynthase (PIS) (aanvullende figuur  24g ). De gevolgen van cytotoxische stress, SCD1-remming en PI (18: 1/18: 1) op eiwitten die betrokken zijn bij intracellulair PI-transport en PIP-metabolisme worden geïllustreerd in aanvullende figuur  24b en samengevat in aanvullende opmerking  8 . Samen dragen de veranderde overvloed aan eiwitten in de biosynthese en het metabolisme van PI waarschijnlijk bij aan veranderde PI-niveaus bij cytotoxische stress, waarbij sommige eiwitten worden gereguleerd door PI (18: 1/18: 1) of andere van SCD1 afgeleide metabolieten.

Om de stressgerelateerde effecten van PI (18: 1/18: 1) op proteoomniveaus af te bakenen, onderzochten we veranderingen in het proteoom geassocieerd met p38 MAPK-signalering, de UPR, autofagie en geprogrammeerde celdood (aanvullende gegevens  3 – 6 ) . Alleen eiwitten werden overwogen, waarvoor CAY10566, VAL en MC de cellulaire niveaus in dezelfde richting verschoven, en PI (18:1/18:1) verzwakte het effect in grotere mate dan de verzadigde controle-PI (16:0/ 16:0). De katalytische subeenheid van serine / threonine-eiwitfosfatase 2 A (Ppp2ca) kwam naar voren als een belangrijk door SCD1 / PI (18: 1/18: 1) gereguleerd eiwit dat uitgeput raakt onder cytotoxische stress (Fig.  8a-c ). In combinatie met regulerende subeenheden defosforyleert Ppp2ca en inactiveert zo p38 MAPK, stroomopwaartse kinasen (bijv. MKK3, MKK6) ^{38, 39 , 40} , en de ER transmembraan serine/threonine-eiwitkinase/endoribonuclease IRE1α, die ER-stress detecteert en de UPR initieert ⁴¹ . Centrale componenten van ER-geassocieerde afbraak (ERAD) werden neerwaarts gereguleerd, waaronder eiwitten die deelnemen aan de herkenning van verkeerd gevouwen eiwitten (Bcap31), ubiquitinatie (Skp1) en proteasomale afbraak (Psmd12, Psmd13) (Fig.  8a, b ). Cytotoxische stress en SCD1-remming verhoogden ook aanzienlijk de overvloed aan autofagiereceptor sequestosoom 1 (Sqstm1, p62) (Fig.  8a-c ).). p62 bevindt zich op het kruispunt van UPR, autofagie en door stress geactiveerde kinasen en triggert selectieve autofagie van alomtegenwoordige lading, stimuleert de activering van initiatorcaspases, draagt ​​bij aan de assemblage van de necroptose-machinerie in afwezigheid van Map3k7 (die ook niet werd gedetecteerd onder cytotoxische stress noch SCD1-remming, aanvullende gegevens  1 ), en initieert diverse mitogene en stress-gereguleerde signaalroutes ^{58 , 59 , 60} .

Aanvullende opmerking  9 beschrijft verdere veranderingen in het proteoom van gestreste cellen die tegengereguleerd worden door SCD1 / PI (18: 1/18: 1) (Fig.  8a – c en aanvullende gegevens  3 – 6 ).

Stresssignalering door door overlijden veroorzaakt verlies van PI (18:1/18:1)

De cytotoxische omstandigheden die in onze studie werden gebruikt, activeerden consistent p38 MAPK (aanvullende figuur  25a ) maar varieerden in hun effect op de UPR (aanvullende figuur  25b ) en autofagie (aanvullende figuur  25c ). Het UPR-markereiwit BiP was aanzienlijk verhoogd door TPG en VAL en minder door MC (aanvullend Fig.  25b ), en het centrale eiwit in ^autofagie , LC3B61 , vertoonde de sterkste PE-conjugatie voor STS, TPG, VAL en MC (aanvullend Fig.  25c). Onze bevindingen bevestigen dat geprogrammeerde celdood nauw verband houdt met fibroblast-stresssignalering, maar onderstrepen ook de heterogeniteit in de respons tussen cytotoxische stressoren. Om te onderzoeken of de daling van PI(18:1/18:1) tijdens celdood stresssignalering oproept, hebben we het lipide in fibroblasten opgenomen met behulp van PI(18:1/18:1)-bevattende liposomen of door niet-veresterde liposomen aan te vullen. 18:1 en vervolgens cytotoxische omstandigheden toegepast. PI (18: 1/18: 1) verminderde (i) de activering van p38 MAPK door de cytotoxische instellingen (aanvullende figuur  25a ), (ii) verminderde LC3B-lipidatie (VAL> TPG, MC> STS) (aanvullende figuur  25c ), en (iii) verminderde de UPR in TPG-, VAL- en MC-behandelde cellen per trend (aanvullend Fig.  25b). De onderdrukking van stresssignalering door PI (18: 1/18: 1) is geassocieerd met een enigszins verzwakte apoptotische progressie onder meerdere cytotoxische omstandigheden (aanvullende figuur  25d ) maar herstelde het aantal levensvatbare cellen niet (aanvullende figuur  25e ), zoals verwacht van het falen van PI (18: 1/18: 1) om het totale aantal necrotische / apoptotische cellen na SCD1-remming te verminderen (Fig.  6e ). Om verder te onderzoeken waarom suppletie van PI (18: 1/18: 1) de afname van het aantal cellen onder cytotoxische omstandigheden niet kon voorkomen, hebben we fibroblasten samen behandeld met VAL en gratis 18: 1, dat efficiënt wordt opgenomen in PI en andere fosfolipiden. (Aanvullende figuur  21a). Hoewel 18: 1 noch de algehele afname van het aantal levensvatbare cellen (aanvullende figuur  27a ) noch de intactheid van het membraan (aanvullende figuur  27b ) verhinderde, verminderde het effectief het aandeel necrotische / apoptotische cellen binnen de fractie van levensvatbare (gehechte) cellen, zoals getoond door PI / annexine V-kleuring (aanvullende figuur  27c, d ). Samen buffert de lipokine PI(18:1/18:1) stressreacties (d.w.z. p38 MAPK-signalering, UPR) bij geprogrammeerde celdood, stemt overlevingsreacties af (d.w.z. autofagie) en, zoals gesuggereerd door 18:1 suppletiestudies , lijkt gunstig te zijn voor de vitaliteit van overlevende cellen onder cytotoxische stress.

PI(18:1/18:1) in het kader van stresstolerantie

Stresssignalering is een centraal element in (patho)fysiologische processen, zoals het ontstaan ​​van tumoren, chemoresistentie, veroudering en infectie. We hebben de PI (18: 1/18: 1) -niveaus in deze contexten gevolgd om het potentieel van het fosfolipide bij het aanpassen van stresstolerantie te onderzoeken. Onze focus lag eerst op kwaadaardige cellen, waarvan het kankerverwekkende, metastatische, immunosuppressieve en chemoresistente vermogen wordt verhoogd door aanhoudende stresssignalering ⁶² . Met name zijn hoge PI(36:2)-niveaus gerapporteerd voor tumorcellijnen en pancreasneoplasie bij muizen en werden toegeschreven aan p53- ^mutaties63 . PI(36:2) omvat meerdere isobare soorten, waaronder PI(18:1/18:1). Om te onderbouwen dat PI(18:1/18:1) wordt gereguleerd tijdens het ontstaan ​​van tumoren, onderzochten we B-cellymfoom van Eµ-Myc-transgene muizen ten opzichte van pre-tumoraal IgM^– B-cellen en vond een sterke ophoping van PI(18:1/18:1) in lymfomen (Fig.  9a ). De toename in PI (18: 1/18: 1) -verhoudingen tijdens kwaadaardige transformatie was geassocieerd met verbeterde Ulk1-fosforylering bij Ser757 (Fig.  9b ). Het effect was minder uitgesproken voor het IgM ⁺ -fenotype (Fig.  9a ) , zoals verwacht op grond van het preferentiële verlies van p53 in IgM- ⁱⁿ vergelijking met IgM ⁺ -lymfomen64 ^. Ulk1 neemt deel aan de initiatie van autofagie en wordt geremd door mTORC1 door fosforylering op Ser757 ⁶⁵ . In overeenstemming met verbeterde mTORC1-activiteit ⁶⁶was de fosforylering van verdere doeleiwitten (4E-BP1, S6-kinase en zijn substraat rpS6, Fig.  9b ) verbeterd. Samen wordt de toename van PI (18: 1/18: 1) bij B-cellymfoom geassocieerd met verhoogde mTORC1-activiteit en remming van ULK1, indicatief voor verminderde autofagie.

Van sorafenib is gemeld dat het kankercellen doodt door SCD1-gemedieerde MUFA-biosynthese te remmen ⁶⁷ . Om de rol van PI(18:1/18:1) bij chemoresistentie te onderzoeken, hebben we Huh-7 hepatocarcinoomcellen gegenereerd, die resistent zijn tegen klinisch relevante piekplasmaconcentraties van sorafenib. p38 MAPK-signalering en ER-stress zijn verhoogd wanneer deze cellen worden blootgesteld aan lage sorafenibconcentraties ⁶⁸ , en we vonden opnieuw dat PI (18: 1/18: 1) -niveaus aanzienlijk verhoogd waren (Fig.  9c ). Deze waarnemingen zijn waarschijnlijk van klinische relevantie omdat p38 MAPK, waarvan de activering wordt gebufferd door PI (18:1/18:1) (Fig.  6a ), de metabole stresstolerantie verbetert en hepatocellulair carcinoom van de muis beschermt tegen door sorafenib geïnduceerde apoptose ¹⁸ .

Veroudering wordt geassocieerd met een sluipende maar progressieve toename van inflammatoire stress, die nauw verband houdt met een afwijkend metabolisme van de immuuncel ⁶⁹ . We vergeleken peritoneale macrofagen van oude en jonge muizen en vonden sterk verhoogde PI (18: 1/18: 1) -niveaus bij ouderen (figuur  9d ). PI (18: 1/18: 1) opregulatie zou een adaptieve strategie van macrofagen kunnen zijn voor met veroudering geassocieerde lichte stress die uiteindelijk hun reactievermogen verlaagt. In overeenstemming met deze hypothese veroorzaakt veroudering verhoogde p38 MAPK-signalering in macrofagen, en selectieve remming van p38 MAPK bij bejaarde individuen herstelt het (macrofaagafhankelijke) vermogen om ontstekingen op te lossen ⁷⁰. Aan de andere kant namen de PI(18:1/18:1)-verhoudingen nogal af in verouderde hematopoietische stamcellen en myeloïde voorlopercellen (Fig.  9e ), die verhoogde stressniveaus hebben in vergelijking met jonge cellen ^{71 , 72 , 73} en zijn vatbaarder voor geprogrammeerde celdood door pyroptosis ⁷⁴ .

In de hersenen van oude mannelijke muizen was PI(18:1/18:1) nauwelijks detecteerbaar, maar het aandeel van de bijna analoge PI(16:1/18:1) nam aanzienlijk af (Fig.  9f ). De daling van PI(16:1/18:1) correleert met een toename van disfunctionele mitochondriën en oxidatieve stress en een afname van autofagie bij ouderen ⁷⁵ . Vrouwen hebben een lagere incidentie van verschillende neurologische aandoeningen en er wordt verondersteld dat hun hersenen minder vatbaar zijn voor leeftijdsgebonden oxidatieve stress ⁷⁶ . Ter ondersteuning van deze hypothese werd het aandeel PI (16: 1/18: 1) gehandhaafd in verouderde vrouwelijke hersenen (Fig.  9f ).

We bestudeerden de gevolgen van uithongering op organismeniveau bij planariërs. Niet-gestresste planariërs behielden constante PI (18: 1/18: 1) -niveaus ondanks dieetbeperkingen (Fig.  9g ). Uithongering verminderde echter duidelijk het aandeel van PI (18:1/18:1) bij planariërs met verminderde ER-stresstolerantie (Fig.  9g ) wanneer ofwel Smed – xbp1 / Smed – atf6 of Smed – cct3A tot zwijgen werd gebracht ⁷⁷ . Om de impact van Smed – cct3A op stresssignalering te onderzoeken, analyseerden we het gepubliceerde cct3A RNAi-transcriptoom van uitgehongerde planariërs ⁷⁷. Het centrale autofagosomale mRNA lc3 (PlanMine id: dd_Smed_v6_2838_0_1) werd aanzienlijk opgereguleerd door cct3A RNAi (Fig.  9h ). Het effect op stressgerelateerde genen die betrokken zijn bij p38 MAPK-activering en apoptose ⁷⁸ (aanvullende tabel  1 ) wordt getoond in figuur  9h en beschreven in aanvullende opmerking  10 . Samen impliceert het veranderde genexpressieprofiel van uitgehongerde planariërs dat cct3A tot zwijgen wordt gebrachtwordt geassocieerd met een verhoogde gevoeligheid voor p38 MAPK-signalering, autofagie en mogelijk apoptose, zoals verwacht van de uitputting van PI (18:1/18:1). Het is verleidelijk om te speculeren dat de daaruit voortvloeiende activatie van p38 MAPK voedingsbeperkingen koppelt aan cytoprotectieve genexpressie ⁷⁹ .

Infecties zijn een andere belangrijke bron voor stresssignalering in de gastheer, waaronder p38 MAPK-activering, ER-stress en autofagie ⁸⁰ . Porphyromonas gingivalis ( P. gingivalis ) activeert botresorberende cellen wat leidt tot alveolaire botafbraak ⁸¹ . Het effect wordt versterkt door een 16:0-rijk dieet (Schulze-Späte et al., in voorbereiding) en komt overeen met SFA-spiegels in het plasma bij obesitas ⁸² . We laten hier zien dat toediening van 16:0 aan muizen het aandeel van PI(18:1/18:1) in tibia verlaagt, wat meer uitgesproken is tijdens infectie met P. gingivalis (Fig.  9i). Serum PI (18:1/18:1) niveaus waren lager bij muizen die een 16:0 dieet hadden gekregen in vergelijking met een normaal dieet, maar daalden vergelijkbaar bij gezonde en geïnfecteerde muizen (Fig.  9j ). Suppletie van 18:1 verhoogde PI(18:1/18:1) ratio’s bij voorkeur in geïnfecteerde tibia, en het verschil tussen niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde muizen nam verder toe toen het eerst toegediende 16:0 dieet werd vervangen door een 18:1- verrijkt dieet (Fig.  9i ).

Tumorigenese, geneesmiddelresistentie, uithongering, veroudering en infectie hebben samen een substantiële invloed op de beschikbaarheid van PI (18:1/18:1) in vitro en in vivo met waarschijnlijke gevolgen voor stresstolerantie.

Discussie

Paden die geprogrammeerde celdood induceren zijn heterogeen en verschillen tussen cytotoxische triggers ⁸³ , wat de identificatie van bioactieve lipiden met algemene relevantie in het doodsprogramma een uitdaging maakt. Door cellen bloot te stellen aan mechanistisch diverse cytotoxische omstandigheden en hun lipidenetwerken te vergelijken, identificeerden we hier de minder belangrijke glycerofosfolipide PI (18: 1/18: 1) als lipokine die stress-inductieve en -adaptieve signalering orkestreert (Fig.  10 ).). PI (18: 1/18: 1) handhaaft cellulaire homeostase, morfologie en proliferatie door (i) p38 MAPK-activering, ER-stress, de UPR en apoptose te onderdrukken, (ii) autofagie te reguleren en (iii) ERAD te activeren. Cellulaire PI (18: 1 / 18.1) -niveaus staan ​​​​onder controle van SCD1, dat wordt onderdrukt door cytotoxische stress via verschillende mechanismen (aanvullende opmerking  11 ). De kinetiek waarmee intracellulaire PI(18:1/18:1)-concentraties toenemen (wat leidt tot aanhoudende beschikbaarheid of een korte puls) bepaalt de cellulaire reacties. Of vroege (p38 MAPK-gerelateerde) stresssignalering SCD1-uitputting initieert en dus stresscondities verergert of dat onafhankelijke mechanismen (veroorzaakt door cytotoxische stress) de oorzaak zijn, kan niet volledig worden beantwoord.

We bevestigden de relevantie van onze bevindingen voor meerdere cellijnen in vitro en belangrijke SCD1 tot expressie brengende weefsels in vivo en leverden sterk bewijs voor een prominente rol van SCD1-afgeleide PI (18:1/18:1) bij het verminderen van stresssignalering in geprogrammeerde cellen. dood. Merk op dat veel cytotoxische stressoren snel p38 MAPK activeren met verschillende mechanismen, kinetiek en grootte (fase I). De tweede fase van p38 MAPK-activering (en mogelijk andere stressreacties) van 6 tot 48 uur is consistenter en wordt aangedreven door de uitputting van SCD1 en PI (18:1/18:1). De directionaliteit en afhankelijkheid van de stresssignaleringsgebeurtenissen worden niet volledig begrepen, evenals de kinetiek die ten grondslag ligt aan andere stressreacties naast p38 MAPK-activering, dwz de UPR en autofagie. Onze conclusies over een gemeenschappelijk mechanisme hebben uitsluitend betrekking op de tweede fase van stressinductie, 12 . Het is verleidelijk om te speculeren dat de stressbeschermende lipokine PI(18:1/18:1) kritisch bijdraagt ​​aan een verscheidenheid aan (patho)fysiologische processen naast geprogrammeerde celdood. Ter ondersteuning van deze hypothese vonden we dat PI(18:1/18:1) wordt opgereguleerd in cellen, weefsels en organismen met verhoogde stresstolerantie, dwz lymfomen, chemoresistente kankercellen en macrofagen van oude muizen, en afneemt in gestresste systemen, dwz uitgehongerde planariërs met beperkte stressaanpassing, verouderde hersenen of parodontale infectie onder lipotoxische stress.

MUFA’s zijn de belangrijkste vetzuren in membraanfosfolipiden en triglyceriden ^3 , 24 . Ze induceren mitogene signaalcascades, versterken de proliferatie en verminderen apoptose en/of ferroptose in verschillende kanker- en niet-kankercellijnen, terwijl SFA’s tegengestelde effecten hebben ^26 , 84 . SCD1, dat in wezen de cellulaire verhouding van SFA’s tot MUFA’s aanpast, verbetert de metabolische profielen van lipiden en de insulinegevoeligheid ^{24 , 85 , 86 , 87 , 88 , 89} , handhaaft de homeostase van de huid ⁹⁰ en ondersteunt tumorgroei ^91 , 92 , metastase ⁹³, kankerstijfheid ⁹⁴ en chemoresistentie ⁹⁵ . We laten hier voor veel cytotoxische aandoeningen zien dat Scd1- transcriptie wordt geremd door de initiatie van geprogrammeerde celdood en dat SCD1-eiwitniveaus snel afnemen, zoals verwacht van het N-terminale degradatiemotief dat de halfwaardetijd van het enzym verkort ⁹⁶ .

MUFA-suppletie en Scd1- knock-outstudies suggereren dat de veelzijdige biologische effecten van MUFA’s en SCD1 in wezen afhangen van veranderingen in membraanverzadiging ³ . In feite verhoogt SCD1 de vloeibaarheid van het membraan ³ en herschikt het microdomeinen ⁹⁷ , waarvan is voorgesteld dat het de functie van membraan(-geassocieerde) eiwitten beïnvloedt. Ter ondersteuning van deze hypothese bevordert fosfolipidenverzadiging c-Src-clustering binnen membranen ⁹⁸ en activeert het direct ER-stresssensoren ^99 , 100. Deze mechanismen verklaren goed waarom exogene SFA’s stresssignalering induceren bij lipotoxische concentraties. Wij en anderen betwijfelden echter of de fysiologische regulatie van SCD1 voldoende veranderingen in de lipidenverzadiging oproept om celsignalering efficiënt te moduleren ³ . Een alternatief mechanisme werd beschreven waarbij SCD1 de accumulatie van verzadigd fosfatidinezuur remt en zo de mineralisatie van vasculaire gladde spiercellen belemmert ¹⁰¹ . Of de SCD1-afhankelijke afname van verzadigd fosfatidinezuur ook deelneemt aan stresssignalering en waarom 18:1 SCD1-remming compenseert, wordt echter niet begrepen. Aan de andere kant stabiliseren MUFA’s microdomeinen die nodig zijn voor Akt-signalering ⁹⁷, maar hoe SCD1 selectiviteit bereikt ten opzichte van andere kinasen bleef ongrijpbaar. Interessant genoeg is Akt verankerd aan membranen en georganiseerd in microdomeinen via PIP’s die worden gegenereerd door PI-fosforylering ^102 , 103 . SCD1-afgeleide MUFA’s remmen verder vetzuuramidehydrolase ¹⁰⁴ , binden zich als liganden aan receptoren zoals G-eiwit-gekoppelde receptor 40 ¹⁰⁵ en zijn vereist als membraanankers van Wnt-eiwitten ¹⁰⁶ . Hoewel deze studies belangrijke inzichten verschaffen in de pleiotrope functies van SCD1-afgeleide MUFA’s, is hun bijdrage aan stress(-adaptieve) signalering onduidelijk.

Concluderend, de mechanismen hoe SCD1 en MUFA’s stresssignalering voorkomen, waren raadselachtig en vereist voor een van SCD1 afgeleid signaleringslipide dat we hier beschrijven als PI (18: 1/18: 1). SCD1 draagt ​​bij aan de biosynthese van diverse membraanlipiden en vrije vetzuren, en absolute veranderingen in MUFA-bevattende PC en PE overtreffen ruimschoots het effect op PI (18:1/18:1). PI(18:1/18:1) vertoont echter de sterkste procentuele afname bij SCD1-remming. De geringe hoeveelheid in combinatie met de hoge gevoeligheid kwalificeert PI(18:1/18:1) voor een effectief signaalmolecuul, waarvan de niveaus snel en substantieel kunnen worden veranderd. Of andere MUFA-PI’s zoals PI (16: 1/18: 1) de lipokine-activiteit van PI (18: 1/18: 1) delen, is nog steeds ongrijpbaar, zoals besproken in aanvullende opmerking  13 .

Mechanistisch laten we zien dat de cytotoxische uitputting van SCD1 de cellulaire beschikbaarheid van de katalytische subeenheid van de serine/threonine-eiwitfosfatase Ppp2ca gedeeltelijk verlaagt via PI(18:1/18:1). Onder de pleiotrope substraten van Ppp2ca zijn centrale spelers in p38 MAPK-activering, UPR-inductie en autofagie-initiatie ¹⁰⁷ . Het vermogen van PI(18:1/18:1) om Ppp2ca-expressie te behouden onder cytotoxische omstandigheden zou dus een reden kunnen zijn voor de stressbeschermende eigenschappen van het fosfolipide. Merk op dat niet alleen de katalytische subeenheid maar ook de proteïnefosfatase 2-steigersubeenheid Aα (Ppp2r1a) aanzienlijk wordt verminderd door cytotoxische stress en SCD1-remming (aanvullende gegevens  1). Verdere verduidelijking is vereist met betrekking tot de volgorde van signaalgebeurtenissen, de cytotoxische mechanismen van Ppp2ca-repressie en de bijdrage van Ppp2ca om het signaal van PI (18: 1/18: 1) over te dragen naar stress (-adaptieve) routes (aanvullende opmerking  7 ) . Of Ppp2r1a of andere regulerende B-subeenheden Ppp2ca-activiteit en substraatspecificiteit ¹⁰⁷ definiëren , blijft ook raadselachtig.

Hoewel onze gegevens sterk ondersteunen dat van SCD1 afgeleide PI (18: 1/18: 1) autofagie reguleert, zijn verdere studies nodig om de directionaliteit te definiëren. Aan de ene kant laten we zien dat CAY10566 de niveaus van LC3B-II verbetert, wat cruciaal is voor de vorming van autofagosoom ⁸ . Aan de andere kant vertoont proteomische profilering verhoogde niveaus van de autofagiereceptor p62. Zowel LC3 als p62 vertonen verbeterde expressie en degradatie bij autofagie-inductie, en dus kunnen onze waarnemingen het gevolg zijn van verminderde of verhoogde autofagische flux ¹⁰⁸ . ^{Deze balans kan ook een reden zijn voor ogenschijnlijk tegenstrijdige bevindingen over MUFA-suppletie en SCD1} -remming, waarvan is voorgesteld dat ze de autofagische flux verhogen of verlagen.. Interessant is dat Ppp2ca een complex vormt met B55α en ULK1 (S637) defosforyleert ⁴² , wat de autofagie-regulerende activiteit van PI (18:1/18:1) onder cytotoxische stress zou kunnen verklaren.

PIP’s reguleren celfysiologie als sleutelfactoren in signaaltransductie, actinedynamiek en membraantransport, waarbij de biologische functie wordt bepaald door de gefosforyleerde kopgroepen ¹¹⁰ . Gezien het brede spectrum van PIP-activiteiten, vroegen we ons af of PI(18:1/18:1) een inactieve voorloper is die wordt geactiveerd door inositolfosforylering. Een dergelijke transformatie van PI(18:1/18:1) in PIP’s zou kunnen worden versneld met 18:1, waarvan werd beschreven dat het PI3K-activiteit in borstkankercellen ^induceert26 . Naar analogie vonden we hier dat van SCD1 afgeleid PI (18: 1/18.1) belangrijk is om de basale beschikbaarheid van fosfatasen en fosfolipases die betrokken zijn bij PIP-afbraak te behouden. Verdere studies zijn nodig om de gevolgen voor PIP-subklassen te onderzoeken.

Concluderend identificeerden we PI (18: 1/18: 1) als SCD1-afgeleid lipokine, dat celhomeostase, morfologie en overleving handhaaft door p38 MAPK-stresssignalering te onderdrukken en stressreacties te beperken, inclusief de UPR en autofagie. Dit mechanisme maakt gebruik van belangrijke stressregulerende eiwitten, waaronder PPP2CA, MLK3/MKK3/6 en p62, en lijkt relevant te zijn voor verschillende celtypen en weefsels, onafhankelijk van de cytotoxische trigger. PI(18:1/18:1) wordt opgereguleerd in stress-tolerante systemen, bijv. verouderde immuuncellen, chemoresistente kankercellen en tumoren, en verlaagd in stressgevoelige systemen, bijv. verouderde hematopoietische stamcellen en hersenen, uitgehongerde planariërs zonder adaptieve stressmechanismen en geïnfecteerd bot onder lipotoxische stress. Bovendien leveren we sterk bewijs dat de vroege cytotoxische uitputting van PI(18:1/18: 1) verbetert stress(-adaptieve) reacties bij geprogrammeerde celdood. Onze gegevens suggereren PI (18:1/18:1) omzet als waardevol doelwit bij stressgerelateerde ziekten zoals het metabool syndroom of kanker en wijzen op vermeende bijwerkingen wanneer ze de SCD1-activiteit verstoren.

methoden

Materialen

CHX, ETO, VAL, I3M en CAY10566 werden gekocht bij Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). STS werd gekocht van Calbiochem (Darmstadt, Duitsland), TPG was van Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) en Q-VD-OPh was van Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Soraphen A, MC en Skepinone-L werden ter beschikking gesteld door respectievelijk Dr. Rolf Müller (Universiteit van Saarland, Duitsland), Dr. Johann Jauch (Universiteit van Saarland, Duitsland) en Dr. Stefan Laufer (Universiteit van Tübingen, Duitsland). Apoptotische inductoren en enzymremmers (zuiverheid ≥ 95%) werden opgelost in DMSO en in porties onder argon bewaard en beschermd tegen licht bij -80 ° C.

TNFa werd verkregen van Peprotech (Hamburg, Duitsland) en verdund in PBS pH 7,4. Fosfolipiden en vetzuren werden gekocht bij Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL), Cayman Chemical of Sigma-Aldrich en opgelost in chloroform, en aliquots werden in het donker bij -80 ° C onder argon bewaard.

konijn anti-fosfo-SEK1 / MKK4 (Ser257; C36C11; 1: 1000; # 4514), konijn anti-fosfo-Ulk1 (Ser757; 1: 1000; # 6888), konijn anti-S6 ribosomaal eiwit (5G10; 1: 1000 ; # 2217), konijn anti-SAPK/JNK (1:1000; # 9252), konijn anti-SCD1 (M38; 1:1000; # 2438), konijn anti-β-actine (13E5; 1:1000; # 4970 ), en muizen-anti-P-actine (8H10D10; 1:1000; # 3700) werden verkregen van Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Konijn anti-LC3B (1:1000; # ab48394), muis anti-p38 MAPK (M138; 1:1000; # ab31828), konijn anti-fosfo-MLK3 (Thr277, Ser281; 1:500 − 1:1000; # ab191530 ), en konijn-anti-Ulk1 (EPR4885(2); 1:1000; # ab128859) waren van Abcam (Cambridge, VK) en konijn-anti-β-actine (1:10.000; # A2066) was gekocht van Sigma-Aldrich. Secundaire antilichamen werden verkregen van LI-COR Biosciences (Lincoln, NE) of Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA).

Cel cultuur

Cellen werden gekweekt bij 37°C en 5% _C02 . Cellijnen waren afkomstig van de DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Duitsland), de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) of de Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank (JCRB Cell Bank, Ibaraki, Japan).

Hechtende cellijnen: Cellen werden geoogst met trypsine/EDTA (GE Healthcare, München, Duitsland of Sigma-Aldrich) en om de drie tot vier dagen opnieuw uitgezaaid. NIH-3T3-fibroblasten van muizen (# ACC 59, DSMZ; 5 x 105/25 ^cm2 ) werden gekweekt in DMEM ^– medium met hoog glucosegehalte (4,5 g/l; Merck, Darmstadt, Duitsland of Thermo Fisher Scientific) dat door warmte geïnactiveerd foetaal kalf bevatte serum (FCS, 10%; Sigma-Aldrich). ^{Menselijke HeLa-cervicaalcarcinoomcellen (# ACC 57, DSMZ; 4} x 105/25 cm2 ) werden gekweekt in DMEM aangevuld met FCS (10%), penicilline/streptomycine (100 E/ml en 100 µg/ml; GE Healthcare ⁾ , en L-glutamine (2 mM; Sigma-Aldrich). RPMI 1640-medium (Sigma-Aldrich) met de bovengenoemde supplementen werd gebruikt voor het kweken van menselijke HT-29 colonadenocarcinoomcellen (# HTB-38, ATCC), menselijke HEK-293 embryonale niercellen (# CRL-1573, ATCC) en humane HepG2-hepatomacellen (# ACC 180, DSMZ), die elk werden gezaaid met 4 tot 5 ^x 105/25 cm2 ^. Menselijke MCF-7 borstadenocarcinoomcellen (# HTB-22, ATCC; 4 x 105/25 ^cm2 ) werden gekweekt in DMEM plus FCS (10%), penicilline/streptomycine (100 U/ml en 100 µg/ml), en 0,1% insuline (Sigma-Aldrich). Humane HUH-7 hepatocarcinoomcellen (# JCRB0403, JCRB Cell Bank; 4 tot 5 × 10 ^5/25 cm ²) werden gehandhaafd in DMEM plus FCS (10%) en penicilline/streptomycine (100 U/ml en 100 µg/ml).

Suspensiecellijnen: Humane MM6 acute monocytische leukemiecellen (# ACC 124, DSMZ; 1,2 x ¹⁰⁶ cellen/4 ml) werden gekweekt in RPMI 1640 dat FCS (10%), penicilline/streptomycine (100 U/ml en 100 µg/ml) bevatte. ml), L -glutamine (2 mM), oxaalzuur (1 mM; Sigma-Aldrich), natriumpyruvaat (1 mM; GE Healthcare) en niet-essentiële aminozuren (1×; Sigma-Aldrich).

Chemoresistente cellijn: Om chemoresistente HUH-7-hepatocarcinoomcellen te bereiden en te karakteriseren, werden resistente HUH-7-cellen verkregen door HUH-7-cellen bloot te stellen aan toenemende doses sorafenib tot 10 µM in het kweekmedium ⁶⁸ . Het medium van sorafenib-resistente HUH-7-cellen werd aangevuld met sorafenib (10 µM; BAY 43 9006, Enzo Life Sciences GmbH, Lörrach, Duitsland) om de weerstand te behouden.

Menselijke primaire cellen: HUVEC’s van menselijke navelstrengaderen werden vriendelijk geleverd door Dr. Alexander Mosig (Universitair Ziekenhuis Jena, Duitsland) ¹¹¹ en gezaaid met 1,5 x 105 cellen/cm2 ⁱⁿ endotheliaal celmedium (ECM) (Promocell, Heidelberg, ^Duitsland ) voor kweken tot passage 4. Menselijke monocyten (1 x 107 ^cellen /4 ml) werden geïsoleerd uit leukocytenconcentraten en onmiddellijk gebruikt voor experimenten. Leukocytenconcentraten werden geleverd door het Instituut voor Transfusiegeneeskunde van het Universitair Ziekenhuis Jena (Duitsland) van gezonde volwassen vrijwilligers met geïnformeerde toestemming ¹¹² , en experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Friedrich-Schiller-Universiteit Jena.

Celbehandeling: Cellen werden uitgezaaid onder de hierboven gespecificeerde omstandigheden, tenzij anders aangegeven. Na 24 uur kweken werden de cellen behandeld met drager, TNFa (10 ng/ml), STS (0,3 µM), CHX (20 µg/ml), ETO (10 µM), TPG (2 µM), VAL (10 µM ), MC (10 µM) of I3M (10 µM) en/of remmers bij 37 °C en 5% CO _2.Voor serumuitputting van NIH-3T3-fibroblasten werd het kweekmedium 24 uur na het zaaien vervangen door serumvrij DMEM. Losgemaakte cellen werden teruggewonnen uit het celkweekmedium om het aantal late apoptotische, necrotische en dode cellen te analyseren, tenzij anders vermeld. In alle andere experimenten werden losgemaakte cellen weggegooid en werden fibroblasten gewassen met PBS pH 7,4 om levensvatbare en vroege apoptotische cellen te verrijken. Menselijke monocyten werden gekweekt onder cytotoxische omstandigheden in RPMI 1640-medium dat FCS (10%), penicilline/streptomycine (100 U/ml en 100 µg/ml) en L-glutamine (2 mM). Cellijnen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden getest op mycoplasma en MCF-7- en HEK-293-cellen werden geverifieerd. De authenticatie werd uitgevoerd door Multiplexion (Friedrichshafen, Duitsland; december 2020) met behulp van Single Nucleotide Polymorphism (SNP)-profilering (Multiplex Cell Line Authentication, https://www.multiplexion.de/en/cell-line-testing-service/multiplex -menselijke-cellijn-authenticatie ). DNA voor SNP-profilering werd geïsoleerd uit celpellets met behulp van een innuPREP DNA Mini Kit (Analytik Jena) volgens de instructies van de fabrikant. Andere cellijnen werden niet geauthenticeerd. De celmorfologie van alle cellijnen werd regelmatig geïnspecteerd. HEK-293 wordt beschreven als een verkeerd geïdentificeerde cellijn, die we hebben bestudeerd vanwege de hoge basale p38 MAPK-fosforylering.

Extractie van lipiden

Fosfolipiden en vetzuren werden geëxtraheerd uit celpellets, plasma, planariërs en weefselhomogenaten door opeenvolgende toevoeging van PBS pH 7,4, methanol, chloroform en zoutoplossing tot een uiteindelijke verhouding van 14:34: 35 ^{: 17113,114 .} Verdamping van de organische laag leverde een lipidefilm op die werd opgelost in methanol en onderworpen aan UPLC-MS/MS. Interne standaarden: 1,2-dimyristoyl- sn -glycero-3-fosfatidylcholine, 1,2-dimyristoyl- sn -glycero-3-fosfatidylethanolamine, 1,2-di-heptadecanoyl- sn -glycero-3-fosfatidylglycerol, 1,2 -diheptadecanoyl – sn -glycero -3-fosfoserine, 1,2-dioctanoyl- sn -glycero -3-fosfo-(1′-myo-inositol) en (15,15,16,16,17,17,18, 18,18-d9)oliezuur.

Voor de extractie van acyl-CoA’s werden NIH-3T3-celpellets opgenomen in waterige methanol (70%) en eiwitten werden geprecipiteerd gedurende 1 uur bij -20 °C ¹¹⁵ . Monsters werden krachtig gemengd, ingesteld op methanol/water (50/50) en gedurende 1 uur bij -20 °C geïncubeerd. Na centrifugatie (20.000 x g, 5 min, 4 °C) werd het supernatant drooggedampt en geëxtraheerd met waterige methanol (50%). Interne standaard: [ ¹³ C ₃ ]-malonyl-CoA (Sigma-Aldrich).

Lipidenanalyse door omgekeerde fase UPLC en ESI tandem MS

Chromatografische scheiding van fosfolipiden en vetzuren werd uitgevoerd op een Acquity UPLC BEH C8-kolom (1,7 μm, 2,1 x 100 mm, Waters, Milford, MA) met behulp van een Acquity ^TM (Waters) ¹¹⁶ of ExionLC™ AD UHPLC (Sciex, Framingham , MA). De ExionLC™ AD UHPLC werd bedreven met een stroomsnelheid van 0,75 ml/min met behulp van mobiele fase A (acetonitril/water, 95/5, 2 mM ammoniumacetaat) en mobiele fase B (water/acetonitril, 90/10, 2 mM ammoniumacetaat). acetaat). De gradiënt werd verhoogd van 75 naar 85% mobiele fase A binnen 5 minuten en naar 100% mobiele fase A binnen 2 minuten gevolgd door isocratische elutie gedurende nog eens 2 minuten. De kolomtemperatuur werd op 45°C gehouden. Geëlueerde lipiden werden gedetecteerd door monitoring van meerdere reacties met behulp van een QTRAP 5500 of QTRAP 6500 ⁺Massaspectrometer (Sciex) uitgerust met een electrospray-ionisatiebron ^29 , 117 . Vetzuuranionen van glycerofosfolipiden werden gedetecteerd in de negatieve ionenmodus door meervoudige reactiemonitoring (MRM) ²¹ . Voor de QTRAP ⁶⁵⁰⁰⁺Massaspectrometer, het gordijngas was ingesteld op 40 psi, het botsingsgas op medium, de ionensproeispanning op 4500 V in negatieve modus, de verwarmde capillaire temperatuur op 350 (PC) – 500 °C (PI), de mantelgasdruk tot 55 psi en het hulpgas tot 75 psi. De meer intensieve overgang werd gebruikt voor kwantificering. Sfingomyelinen werden geanalyseerd in de positieve ionenmodus op basis van de detectie van de cholinekopgroep (m/z = 184) door MRM (botsingsenergie: 33 eV). Vrije vetzuren werden gekwantificeerd in de negatieve ionenmodus door enkelvoudige ionenbewaking.

Voor de analyse van triglyceriden en cholesterylester werden acetonitril/water (95:5, 10 mM ammoniumacetaat, mobiele fase A, 100%) en isopropanol (mobiele fase B) verhoogd van 100% A naar A/B = 70/30 gedurende 6 min gevolgd door isocratische elutie gedurende 4 min ²⁹ . Monitoring van meerdere reacties richtte zich op de fragmentatie van [M + NH ₄ ] ⁺ adductie-ionen tot [M – vetzuuranion] ⁺ ionen, zonder onderscheid te maken tussen vetzuurpositionele isomeren. De botsingsenergie was ingesteld op 35 eV (triglyceriden) of 22 eV (cholesterylester) en het declusteringspotentieel op 55 (CE) − 120 V (TAG).

Acyl-CoA-ester van SFA’s en MUFA’s werden gescheiden op een Acquity ^TM UPLC BEH C18-kolom (1,7 µM, 2,1 x 50 mm) en gedetecteerd met MRM op basis van het neutrale verlies van 2′-fosfo-ADP ([M + H-507 ] ⁺ ) in de positieve ionenmodus ¹¹⁵ . De botsingsenergie werd ingesteld op 45 eV en het declusteringspotentieel op 60 V.

Absolute hoeveelheden lipiden verwijzen naar de interne standaard van de subklasse en zijn genormaliseerd naar celaantallen, eiwitgehalte of weefselgewicht. Relatieve verhoudingen van lipiden worden gegeven als percentage van de som van alle soorten gedetecteerd in de respectievelijke subklasse (=100%). Om het cellulaire aandeel van fosfolipide-gebonden MUFA’s te berekenen, hebben we de relatieve intensiteiten samengevat van fosfolipidensoorten die ten minste één vetzuur met een enkele dubbele binding bevatten. Massaspectra werden verkregen en verwerkt met behulp van Analyst 1.6 of 1.7 (Sciex) ¹¹⁷ .

SDS-PAGE en western blotting

Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM natriumfluoride, 10 μg/ml leupeptine, 60 μg / ml sojaboontrypsineremmer, 1 mM natriumvanadaat, 2,5 mM natriumpyrofosfaat en 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride] en gesonificeerd (2 x 5 s, op ijs). Muizenweefsels (100 mg / ml) werden gehomogeniseerd met behulp van een Omni-weefselhomogenisator TH (Kennesaw, GA) of POLYTRON PT 1200 E Homogenizer (Kinematica, Eschbach, Duitsland) in lysisbuffer. Monsters werden één keer gecentrifugeerd (12.000 x g, 5 min, 4 °C) voor cellulaire monsters of tweemaal voor murine weefsels (15.000 x g, 10 min, 4 °C). De eiwitconcentraties van de supernatanten werden geanalyseerd met een DC-eiwitassaykit (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Duitsland). Supernatanten werden aangepast aan dezelfde eiwitconcentraties, gemengd met 1 × SDS/PAGE monsterlaadbuffer [125 mM Tris-HCl pH 6,5, 25% (m/v) sucrose, 5% SDS (m/v), 0,25% (m/v) broomfenolblauw en 5% (v/v) β-mercaptoethanol], en gedurende 5 minuten verwarmd op 95 °C. Aliquots (10-20 µg) werden gescheiden door 10-15% SDS-PAGE en overgebracht naar een Hybond ECL nitrocellulosemembraan (GE Healthcare, München, Duitsland). Membranen werden geblokkeerd met 5% (m/v) BSA of magere melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C.

Als secundaire antilichamen, IRDye 800CW-gelabeld anti-konijn of anti-muis IgG (1:10.000, elk; anti-muis: # 926-32210; anti-konijn: # 926-32211; LI-COR Biosciences), IRDye 680LT- gelabeld anti-konijn of anti-muis IgG (1:80.000, elk; anti-muis: # 926-68020; anti-konijn: # 926-68021; LI-COR Biosciences), DyLight® 800 anti-konijn IgG (1: 10000; # SA510036; Thermo Fisher Scientific), en/of DyLight® 680 anti-muis of anti-konijn IgG (1:10000, elk; anti-muis: # 35519; anti-konijn: # 35569; Thermo Fisher Scientific) waren gebruikt. Fluorescentiesignalen werden gedetecteerd door een Odyssey-infraroodbeeldcamera (LI-COR Biosciences) of Fusion FX7 Edge Imaging System (spectralichtcapsules: C680, C780; emissiefilters: F-750, F-850; VILBER Lourmat, Collegien, Frankrijk). Gegevens van densitometrische analyse werden lineair aangepast en achtergrondgecorrigeerd, en eiwitniveaus werden genormaliseerd naar β-actine (Odyssey-systeem). Bij gebruik van het Fusion FX7-systeem werd densitometrische analyse uitgevoerd met Evolution-Capt Edge-softwareversie 18.06 (VILBER Lourmat) met behulp van rollende bal-achtergrondaftrekking, en eiwitniveaus werden genormaliseerd naar β-actine of GAPDH.

Membranen van onafhankelijke datasets werden genormaliseerd naar totale bandintensiteiten om variërende scaninstellingen te compenseren.

Niet-bijgesneden blots worden getoond in de brongegevens (hoofdfiguren) en aanvullende figuren. 28 – 37 (aanvullende cijfers).

Analyse van cellulaire PIP ₃ – niveaus

NIH-3T3 fibroblasten (1,5 x ^106/75 cm2 ) werden ²⁴ uur gekweekt bij 37°C en 5% _CO2 . Na behandeling met drager of CAY10566 gedurende 48 uur werd PIP ₃ geëxtraheerd en gekwantificeerd met behulp van een PIP3 Mass ELISA Kit (K-2500s; Echelon Biosciences Inc., Salt Lake City, UT). Kortom, het kweekmedium werd weggegooid en de cellen werden onmiddellijk behandeld met ijskoud 0,5 M trichloorzuur (TCA), gecentrifugeerd en tweemaal gewassen met 5% TCA/1 mM EDTA. Nadat neutrale lipiden uit de pellet waren verwijderd met methanol/chloroform (2:1), werden zure lipiden (inclusief PIP3 ₎ geëxtraheerd met methanol/chloroform/12 N HC1 (80:40:1) en vervolgens uit het supernatant met chloroform/ 0,1 N HC1 (36:64). PIP ₃concentraties werden bepaald volgens de instructies van de fabrikant en genormaliseerd naar het eiwitgehalte. Eiwitniveaus werden bepaald met behulp van een DC-eiwitassaykit (Bio-Rad Laboratories GmbH) in TCA-aangezuurde cellulaire monsters (100 µl) na neutralisatie met NaOH (1 M, 50 µl) en toevoeging van waterig Triton X-100 (10%, 15 µl). Absorptie werd gemeten met behulp van een SpectraMax iD3 Microplate Reader die werd bediend door SoftMax Pro 7.1 (Molecular Devices, San José, CA).

Muizen

Muizen werden gehuisvest in een gecontroleerde omgeving (temperatuur: 22 ± 2 °C; vochtigheid: 40-70%) en voorzien van standaard knaagdiervoer en water. Dieren werden onderworpen aan een schema van 12 uur licht/12 uur donker.

Leeftijd muriene ingezetene peritoneale macrofagen en hersenen

Om PI (18: 1/18: 1) -verhoudingen in residente peritoneale macrofagen en hersenen te bestuderen, ontvingen we mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6JRj-muizen (26 maanden) van de dierenfaciliteit van het Leibniz Institute (Jena, Duitsland). Jonge mannelijke en vrouwelijke C57BL/6JRj-muizen (6-8 maanden) werden gekocht bij Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, Frankrijk). Muizen werden gedood door inademing van CO _{2 .} Residente peritoneale macrofagen werden verkregen door lavage van de peritoneale holte met 7 ml koude DMEM met heparine (5 U ml ^-1 ).

Organen en weefsels van muizen met defecte Scd1- mutatie

Mannelijke C57BL/6-muizen (6 weken) werden verkregen van de dierenfaciliteit van het Leibniz Instituut (Jena, Duitsland), gedood in een verzadigde C02 _– atmosfeer, en de skeletspier van de achterpoten, wit buikvet, lever en huid werden verzameld. Respectievelijke weefsels van mannelijke C57BL/6 J-muizen die homozygoot zijn voor het Scd1 ^ab-2J- allel (6 weken) werden gekocht bij Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Muisorganen, weefsels en residente peritoneale macrofagen werden gehomogeniseerd in lysisbuffer voor Western-blotanalyse of in PBS pH 7,4 voor lipide-extractie en UPLC-MS/MS-analyse.

Isolatie van hematopoietische stam- en progenitorcellen

Beenmergcellen, die vers werden geïsoleerd uit scheenbeen en dijbeen van mannelijke en vrouwelijke jonge (3 tot 6 maanden) en oude (18 tot 24 maanden) C57BL/6-muizen, werden verrijkt door magnetisch geactiveerde celscheiding (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Duitsland), geïmmunolabeld met Sca-1 en afstammingsantilichamen en gesorteerd op FACS ¹¹⁸ . In het kort werden gemalen botmonsters geïncubeerd met allophycocyanine (APC)-geconjugeerde anti-muis c-Kit (kloon 2B8; 1:100; # 17-1171; Thermo Fisher Scientific) gedurende 30 minuten bij 4 °C en gecombineerd na wassen met anti-APC-microbeads (Miltenyi Biotech). cKit ⁺cellen werden magnetisch verrijkt met behulp van een LS-kolom (Miltenyi Biotech) en gedurende 30 minuten bij 4 ° C en met APC anti-muis c-Kit (kloon 2B8; 1:100; # 17-1171; Thermo Fisher Scientific), PE/Cy7 anti-muis Sca-1 (kloon E13-161.7; 1:100; # 122513; BioLegend, San Diego, CA) en APC/Cy7 -geconjugeerd streptavidine (1:100; # 405208; BioLegend) overnacht bij 4 °C. Na kleuring met DAPI werden Lin ^– cKit ⁺ ScaI ⁺ (KSL) -cellen en Lin ^– cKit ⁺ ScaI ^– myeloïde voorlopercellen (MP) -cellen gesorteerd met behulp van een FACSAria II-instrument (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). FlowJo-software werd gebruikt voor data-analyse.

Genereren en verzamelen van B-cellymfomen

B-cellen van 8 weken oude mannelijke wildtype of Tg(IghMyc)22Bri (“Eµ-Myc”) muizen met C57BL/6JRj achtergrond ¹¹⁹werden geïsoleerd met behulp van een negatieve selectietechniek (MagniSort Mouse B-celverrijkingskit, Thermo Fisher Scientific). IgM-positieve B-cellen werden geïsoleerd uit de milt met behulp van een standaard antilichaamcocktail die in de kit werd geleverd, en IgM-negatieve B-cellen werden geïsoleerd uit beenmerg met behulp van de standaard antilichaamcocktail met toevoeging van gebiotinyleerd anti-IgM-antilichaam (kloon R6-60.2). ; 1:100; # 553406; BD Biosciences). Tumorcellen werden geïsoleerd uit inguinale en axiale lymfeknopen van mannelijke en vrouwelijke tumordragende Eµ-Myc transgene muizen van 15 tot 52 weken oud. In het kort werden enkelvoudige celsuspensies verkregen door mechanisch openbreken in PBS pH 7,4, gefiltreerd en gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 700 x g. Supernatanten werden verwijderd en opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer van rode bloedcellen (8,3 g/l ammoniumchloride in 0,01 M Tris-HCl pH 7,4). Doelcellen werden geïsoleerd volgens het protocol van de fabrikant. Zuiverheid en IgM-status van geïsoleerde cellen werden bevestigd door flowcytometrie (anti-CD19-APC; kloon 1D3; 1:1000; # 152410; BioLegend en anti-IgM-PE-Cy7; kloon eB121-15F9; 1:100; # 25 -5890-82; Thermo Fisher Scientific).

Parodontaal infectiemodel onder met vetzuur verrijkte diëten

4 weken oude mannelijke C57BL / 6-muizen (Universitair Ziekenhuis Jena, Jena, Duitsland) werden willekeurig verdeeld in groepen (n = 6 / groep) en kregen ofwel 16: 0- of 18: 1-verrijkte isocalorische diëten (20% calorieën uit vet) (Ssniff, Soest, Duitsland) gedurende in totaal 16 weken. P. gingivalis W50 (# 53978, ATCC) werd gekweekt in gedefinieerd medium, en P. gingivalis /placebo-inoculatie via orale sondevoeding begon in week 10 van de gespecialiseerde voeding ⁸² . Een week na de laatste orale infectie werden de dieren opgeofferd en bot-/serummonsters werden verzameld en gehomogeniseerd ⁸² voorafgaand aan lipidenextractie en analyse van PI-profielen door UPLC-MS/MS. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Universitair Ziekenhuis Jena (UKJ-17-036).

Studies over planariërs

Planariërs die in dit werk worden gebruikt, behoren tot de soort Schmidtea mediterranea aseksueel biotype. De dieren werden op 19°C gehouden in 1 x Montjuïc-zouten (1,6 mM NaCl, 1 mM CaCl2 _, 1 mM MgS04 , 0,1 mM MgCl2 , 0,1 mM KCl, 0,1 g/l NaHC03 ₎ en gevoed met organische kalfslever. Voor RNAi-experimenten op planariërs werden sjablonen met T7-promoters toegevoegd aan beide strengen ¹²⁰ gegenereerd voor Smed-xbp1 , Smed-atf6 en Smed-cct3A. Dubbelstrengs RNA (dsRNA) werd gesynthetiseerd door in vitro transcriptie met een MEGAscript RNAi-kit (Ambion) en dsRNA werd in de planariër geïnjecteerd. De volgende oligonucleotiden werden gebruikt om sjablonen voor dsRNA-productie te genereren: (1) Smed-xbp1-F: 5′-TAGGTGGGAATGGTATGGGAAA-3′, Smed-xbp1-R: 5′-CACAACCAAACTCTGACATTTCG-3′; (2) Smed-atf6-F: 5′-AAGCCAGTTGTTAAGCCAGAAA-3′, Smed-atf6-R: 5′-CCATGATAACCGGGAAATGAAGA-3′; (3) Smed-cct3A-F: 5ʹ-CGTCGTTTTGAGTGGAGTTTTG-3ʹ, Smed-cct3A-R: 5ʹ-TTGATATTGCCATCTCCAATGC-3ʹ ⁷⁷ . Controledieren werden geïnjecteerd met gfpdsRNA (GenBank: M62653.1), een sequentie die niet aanwezig is in het planaire genoom. Uitgehongerde planariërs waren 7 dagen uitgehongerd bij het starten van de RNAi-injectie, terwijl gevoede planariërs 1 dag uitgehongerd waren. Planariërs werden anterieur en posterieur van de keelholte geamputeerd op dag 8 na de eerste injectie en alleen stammen werden verwerkt voor lipide-extractie. RNA-Seq-gegevens van een eerdere studie ⁷⁷ zijn gedeponeerd in Expression Omnibus (GEO) met toegangsnummer GSE134013. Significantie werd bepaald door q -waarde (false discovery rate (FDR)) < 0,1 voor paarsgewijze vergelijkingen. TPM’s zijn transcripties per miljoen.

Remming van ACC1 en SCD1 door RNA-interferentie

NIH-3T3-cellen (ACC1: 5 x 105 ^/ 25 cm2 ^; SCD1: 1,5 x 105 ^/ 9,5 cm2 ) werden gekweekt tot ongeveer 60% confluentie voordat ze werden getransfecteerd met siRNA-duplexen (15 nM) met behulp van Lipofectamine RNAiMax-transfectiereagens ( 10 µl; Invitrogen). Voor het dempen van Acc1 gebruikten we de Acaca (ID 107476) Trilencer-27 Mouse Acc1siRNA (OriGene, Rockville, MD) dat gericht was tegen de sequentie 5ʹ-AAGCUACUUUGGUUGAGCAUGGCAT-3ʹ (84% knockdown-efficiëntie). Controletransfecties werden uitgevoerd met behulp van universele gecodeerde siRNA-duplex met negatieve controle (OriGene, Rockville, MD). Voor SCD1 knockdown hebben we drie verschillende FlexiTube GeneSolution-siRNA’s (QIAGEN, Hilden, Duitsland) getransfecteerd die gericht waren op respectievelijk de sequenties 5ʹ-CACAACAGCTTTAAATAATAA-3ʹ, 5ʹ-TAGTGAGATTTGAATAATTAA-3ʹ of 5ʹ-CGGTACAGTATTCTTATAAA-3ʹ. Medium werd na 5 uur vervangen. On-TargetPlus nontargeting siRNA #1 (Thermo Fisher Scientific) werd gebruikt als gecodeerde controle.

Kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd uit fibroblasten met EZNA Total RNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA) of innuPREP RNA Mini Kit 2.0 (Analytik Jena, Jena, Duitsland) en getranscribeerd in cDNA door SuperScript III (Invitrogen) of qScript cDNA Synthesis Kit (Quantabio, Beverly, MA). PCR werd uitgevoerd in Mx3000P-platen met 96 putjes met behulp van een Stratagene Mx 3005 P qPCR-systeem (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) met ≤10 ng/µl cDNA, 1× Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific), en 0,5 µM voorwaartse en achterwaartse primer (TIB MOLBIOL, Berlijn, Duitsland) of in Multiply ^® -µStrip (0,2 ml witte) strips (Sarstedt, Nümbrecht, Duitsland) met behulp van een qTower ³G-systeem (Analytik Jena) met 0,75 ng/µl cDNA, innuMIX qPCR DSGreen Standard (Analytik Jena) en 0,6 µM voorwaartse en achterwaartse primer (Sigma-Aldrich). Primerinformatie wordt gegeven in aanvullende tabel  2 . PCR-omstandigheden met Stratagene Mx 3005 P qPCR-systeem: 95 °C gedurende 10 minuten gevolgd door 45 cycli van 15 seconden bij 95 °C, 30 seconden bij 61 °C en 30 seconden bij 72 °C. PCR-omstandigheden met behulp van qTower ³ G: 95 °C gedurende 2 minuten gevolgd door 60 cycli van 20 seconden bij 95 °C en 45 seconden bij 57 °C. Threshold cycle-waarden werden berekend door MXPro – Mx3005P v4.10-software (Agilent Technologies) of qPCRsoft v4.1.3.0-software (Analytik Jena) en genormaliseerd naar de hoeveelheid RNA of Actb .

Analyse van het aantal cellen, de levensvatbaarheid en de morfologie

Het aantal cellen en de intactheid/levensvatbaarheid van het membraan werden bepaald na kleuring met trypaanblauw met behulp van een Vi-CELL Series Cell Counter (Beckman Coulter, Krefeld, Duitsland; software: Vi-Cell XR Cell Viability Analyzer, versie 2.03 of 2.06.3). Cellen werden gevisualiseerd door een Axiovert 200 M microscoop met een Plan Neofluar × 100/1.30 Oil (DIC III) objectief (Carl Zeiss, Jena, Duitsland). Afbeeldingen zijn gemaakt met een AxioCam MR3-camera met AxioVision 4.8 (Carl Zeiss).

Immunofluorescentiemicroscopie

NIH-3T3-cellen (5 × 10 ³ /3,5 cm ²) werden uitgezaaid op glazen dekglaasjes en gekweekt in aanwezigheid van drager (DMSO), CAY10566 (3 µM) en/of fosfolipideblaasjes (50 µM) gedurende 42 uur. Het kweekmedium, bestaande uit DMEM plus 10% FCS, werd vervangen door medium dat bovendien 16:0 (400 µM) bevatte, en de behandeling met drager, CAY10566, en/of fosfolipide werd gedurende 6 uur voortgezet. Cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde (20 min, kamertemperatuur), permeabel gemaakt met behulp van 0,25% Triton X-100 (10 min, 4 °C) en geblokkeerd met 5% normaal geitenserum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Monsters werden overnacht bij 4 ° C geïncubeerd met muis-anti-GRP78-antilichaam (A-10; 1: 250; # sc-376768; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) en gekleurd met Alexa Fluor 555 geit-anti-muis IgG (1: 1000; # A32727; Thermo Fisher Scientific) gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Nucleair DNA werd gekleurd door ProLong Diamond Antifade Mountant met DAPI (Thermo Fisher Scientific). Monsters werden geanalyseerd door een Axiovert 200 M microscoop (Carl Zeiss) uitgerust met een Plan Neofuar x 100/1.30 Oil (DIC III) objectief (Carl Zeiss). Afbeeldingen zijn gemaakt met een AxioCam MR3-camera en lineair aangepast in helderheid en contrast door AxioVision 4.8-software (Carl Zeiss).

Annexine-V en propidiumjodidekleuring van apoptotische cellen

NIH-3T3-cellen (3 x 105 ^/ 9,5 cm2 of 5 x 105 ^/ 25 cm2 ^) werden behandeld met vehiculum (DMSO), CAY10566 (3 µM), etoposide (10 µM) en/of PI-blaasjes (50 µM). µM) of met voertuig (DMSO), VAL (10 µM) en/of 18:1 (100 µM). Na 48 uur bij 37 °C en 5% CO ₂werden cellen gekleurd met propidiumjodide en annexine-V met behulp van ofwel een Annexine V Apoptosis Detection Kit APC (Thermo Fisher Scientific) of een Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC (Thermo Fisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden geanalyseerd met een BD LSR Fortessa flowcytometer (BD Biosciences) en gegevens werden verwerkt door BD FACSDiva (BD Biosciences) en FlowJo (BD Biosciences) of Flowlogic-software (Miltenyi Biotech). De poortstrategie wordt geschetst in aanvullende afbeelding  38 .

Immunoprecipitatie

NIH-3T3-cellen (5 x ^105/25 cm2 ) werden gedurende 48 uur behandeld met drager (DMSO) of CAY10566 (3 µM) ^. Na wassen met ijskoude PBS pH 7,4 en schrapen in 500 µl ijskoude lysisbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, 1 mM EDTA, 1 mM natriumvanadaat, 1 mM EGTA, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat, 1 µg/ml leupeptine, 1 mM fenylmethaansulfonylfluoride), cellen werden gesoniceerd op ijs (3 x 5 s). Het lysaat werd gecentrifugeerd (14.000 x  g, 10 min, 4 °C), en een aliquot (200 µl, 1 mg/ml totaal eiwit) werd vooraf geklaard door 20 min te incuberen met 20 µl proteïne A magnetische korrelslurry (Cell Signaling, #73778) bij kamertemperatuur. temperatuur. Het vooraf geklaarde lysaat werd gescheiden van de korrels met behulp van een magneet en geïncubeerd met anti-fosfo-tyrosine van konijnen (p-Tyr-1000, #8954, 1:200) onder rotatie gedurende 16 uur bij 4°C. De gevormde immunocomplexen werden gecombineerd met gewassen proteïne A magnetische bolletjes (20 µl suspensie). Na 20 minuten bij kamertemperatuur werden parels verzameld door magnetische scheiding en herhaaldelijk gewassen met lysisbuffer. Eiwitten werden losgemaakt in SDS/PAGE-monsterbeladingsbuffer (20 µl) en onderworpen aan SDS-PAGE en kwantitatieve proteomics.

In-gel vertering van eiwitten

Van belang zijnde eiwitbanden werden uit de met Coomassie gekleurde SDS-PAGE-gels gesneden, in kleine stukjes gesneden, herhaaldelijk gewassen met 25 mM NH4HC03 in water _{en ontkleurd} met 50% ACN / 25 mM _NH4HC03 in water _. De eiwitten werden vervolgens gereduceerd met 10 mM dithiothreitol bij 50 °C gedurende 1 uur en gealkyleerd met 55 mM jodaceetamide bij kamertemperatuur in het donker gedurende 45 minuten. Ontkleurde, gewassen en gedehydrateerde gelstukken werden gedurende 60 minuten gerehydrateerd in een oplossing van 12 ng/µl varkenstrypsine (Promega) in 25 _mM waterig _NH4HC03bij 4 °C en overnacht geïncubeerd bij 37 °C. De tryptische peptiden werden met 75% ACN / 5% mierenzuur uit de gel geëxtraheerd en in een vacuümconcentrator (SpeedVac, Thermo Fisher Scientific) gedroogd. Voor nanoUPLC-MS ^E – analyse werden monsters gereconstrueerd in 30 μl waterig 1% mierenzuur.

LC-MS ^E – analyse

1 μL van elk monster werd online geïnjecteerd op een UPLC M-klasse systeem (Waters) gekoppeld aan een Synapt G2-si massaspectrometer (Waters). Monsters werden eerst online voorgeconcentreerd en ontzout met behulp van een UPLC M-Class Symmetry C18 trapkolom (100 Å, 180 µm × 20 mm, 5 µm deeltjesgrootte; Waters) met een stroomsnelheid van 15 µl/min (0,1% waterig mierenzuur). Peptiden werden geëlueerd op een ACQUITY UPLC HSS T3 analytische kolom (100 A, 75 µm x 200 mm, 1,8 µm deeltjesgrootte; Waters) met een stroomsnelheid van 350 nl/min gebruikmakend van een toenemende acetonitril gradiënt met 2-10% B over 5 min, 10-40% B gedurende 40 min, 40-70% B gedurende 7 min, 70-95% B gedurende 3 min, isocratisch bij 95% B gedurende 2 min, en een terugkeer naar 1% B (buffers: A, 0,1% mierenzuur in water; B, 100% acetonitril in 0,1% mierenzuur).

De geëlueerde peptiden werden overgebracht naar de massaspectrometer die bedreven werd in V-modus met een oplossend vermogen van ten minste 20.000 volledige breedte bij halve hoogte FWHM. Alle analyses werden uitgevoerd in een positieve ESI-modus. Een oplossing van 100 fmol/µl humaan Glu-fibrinopeptide B in 0,1% mierenzuur/acetonitril (1:1 v/v) werd geïnfundeerd met een stroomsnelheid van 1 µl/min door de referentiesproeier om de 45 seconden om massaverschuivingen te compenseren in MS- en MS/MS-fragmentatiemodus.

Gegevens werden verkregen met behulp van data-onafhankelijke acquisitie (DIA), aangeduid als verbeterde ^MSE . MS-gegevens werden verzameld met behulp van MassLynx v4.1-software (Waters).

Gegevensverwerking en eiwitidentificatie

De verkregen continuüm LC-MS ^E – gegevens werden verwerkt met behulp van ProteinLynx Global Server (PLGS) versie 2.5.2 (Waters) om productionenspectra te genereren voor het zoeken in databases volgens het Ion Accounting-algoritme ¹²¹ . De verwerkte gegevens zijn doorzocht in de Swissprot-database (2019_01). Het zoeken in de database werd uitgevoerd met een False Discovery Rate (FDR) van 2% en er werden strikte criteria gebruikt. De volgende zoekparameters werden toegepast voor het minimum aantal: fragmenten per peptide (3), peptiden per eiwit (1), fragmenten per eiwit (7) en maximum aantal gemiste tryptische splitsingsplaatsen (1). Zoekopdrachten waren beperkt tot tryptische peptiden met een vaste carbamidomethylering van cysteïnen.

Voor kwantificering werd een universele responsfactor berekend uit trypsine (de gemiddelde intensiteit van de drie meest intense peptiden) ¹²² .

Extractie van eiwitten en lipiden voor multiomics

NIH-3T3-cellen in kolven van 25 cm2 ^werden driemaal gewassen met ijskoude PBS pH 7,4 (2 ml) en geschraapt in methanol (500 µl, -20°C) en water (500 µl). Monsters werden gecombineerd met chloroform (500 µl, -20 °C) en gedurende 20 minuten geschud (1400 cycli/min, 4 °C). Na centrifugatie (16.100 x  g , 4 ° C, 5 min) werden polaire en niet-polaire fasen evenals de interfase verzameld. Polaire en niet-polaire fasen werden onder vacuüm bij kamertemperatuur gedroogd met behulp van een Eppendorf Concentrator Plus-systeem (Hamburg, Duitsland; polaire fase: waterige applicatiemodus; niet-polaire fase: applicatiemodus met hoge dampdruk). Het residu van de niet-polaire fase werd opgelost in methanol en onderworpen aan lipidomics-analyse (aanvullende figuren  3c en 20b). De interfase werd gewassen met methanol (-20 ° C) en gecentrifugeerd (16.100 x  g, 4 °C, 10 minuten). De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in denaturatiebuffer (8 M ureum, 100 mM ammoniumbicarbonaat; 60 µl) en 5-voudig verdund in waterig ammoniumbicarbonaat (100 mM). Na sonicatie (Branson Ultrasonics ™ Sonifier Modell 250 CE, Thermo Fisher Scientific, parameters: 1 × 10 s, constante werkcyclus, outputcontrole: 2, kamertemperatuur), werden geëxtraheerde eiwitten gekwantificeerd met behulp van een Pierce Micro BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Wetenschappelijk). Eiwitten (50 µg in 285 µl) werden gereduceerd met dithiothreitol (10 mM) bij 55°C gedurende 30 min en gealkyleerd door joodacetamide (20 mM, 30 min) bij kamertemperatuur in het donker. De reactie werd na 30 minuten gestopt door toevoeging van overmaat dithiothreitol. Monsters werden verdund, onderworpen aan tryptische digestie (16 uur, kamertemperatuur, sequencing grade gemodificeerd trypsine; Promega, Madison, WI), aangezuurd met mierenzuur (4. 6 µl) en gecentrifugeerd (5 min, 16.000 g, kamertemperatuur). Peptiden in het supernatant werden overgebracht naar Sep-Pak 100 patronen (30 mg, Waters). Na wassen met mierenzuur (1% in water) werden de peptiden geëlueerd met ACN/H₂ O/mierenzuur (70/29/1), onder vacuüm gedroogd en gebruikt voor proteomics-analyse.

Kwantitatieve proteomics

Voor LC-MS/MS-analyse werden de gedroogde tryptische peptiden opgelost in 20 µl 0,1% waterig mierenzuur. De monsters werden geïnjecteerd op een nano-ultradrukvloeistofchromatografiesysteem (Dionex UltiMate 3000 RSLCnano pro flow, Thermo Fisher Scientific) gekoppeld via een elektrospray-ionisatiebron (ESI, nanospray flexion-bron) aan een Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). De monsters werden geladen (20 µl/min) op een opvangkolom (Acclaim PepMap cartridge, C18, 5 μm, 1 mm x 5 mm, Waters, buffer A: 0,1% mierenzuur in HPLC- _H20 ; buffer B: 80 % acetonitril, 0,1% mierenzuur in HPLC- _H2O) met 5% buffer B. Na het laden van het monster werd de vangkolom 5 minuten gewassen met 5% buffer B (15 μl/min) en werden de peptiden geëlueerd (300 nl/min) op de scheidingskolom (nanoE MZ PST CSH, 130 Å, C18 1,7 μm, 75 μm × 250 mm, Waters) en gescheiden met een gradiënt van 5 – 30% B in 120 min. De spray werd gegenereerd door een stalen zender (Fisher Scientific, Dreieich, Duitsland) bij een capillaire spanning van 1900 V. MS/MS-metingen werden uitgevoerd in data-afhankelijke acquisitiemodus (DDA) met behulp van een genormaliseerde HCD-botsingsenergie van 30% volledig snelheidsmodus. Elke seconde werd een MS-scan uitgevoerd over een m/z-bereik van 350-1600, met een resolutie van 120.000 bij m/z 200 (maximale injectietijd = 120 ms, AGC-doel = 2e5). MS/MS-spectra werden opgenomen in de ionenval (snelle scanmodus, maximale injectietijd = 60 ms, maximaal AGC-doel = 1e4,

Voor gegevensanalyse werden onbewerkte bestanden geanalyseerd met ProteomeDiscoverer 2.4 (Thermo Fisher Scientific). Voor peptide- en eiwitidentificatie werden de LC-MS/MS doorzocht met SequesHT tegen een muizendatabase (SwissProt, 17.023 ingangen) en een verontreinigingendatabase (116 ingangen). De volgende parameters werden gebruikt voor het zoeken in de database: massatolerantie MS1: 6 ppm, massatolerantie MS2: 0,5 Da, vaste modificatie: carbamidomethylering (cysteïne), variabele modificatie: oxidatie (methionine), variabele modificatie aan eiwit N-terminus: acetylering, Methionineverlies, methionineverlies + acetylering. Pathway-analyse (p38 MAPK-signalering, UPR, autofagie, geprogrammeerde celdood, PI-biosynthese / metabolisme) werd uitgevoerd op basis van eiwitten vermeld in Reactome-, Wiki- en Kegg-pathways (aanvullende gegevens  2 – 6). Bovendien hebben we pathway-gerelateerde eiwitten geëxtraheerd uit recente overzichtsartikelen ^{41 , 123 , 124 , 125 , 126 , 127 , 128} .

Percolator werd gebruikt voor FDR-berekening. Voor functiedetectie werd Minora Feature Detection gebruikt met standaardinstellingen. Voor labelvrije kwantificering werd de Precursor Ions Quantifier gebruikt met de volgende parameters: Te gebruiken peptiden: unieke peptiden, Precursor-abundantie gebaseerd op: oppervlakte, minimale replicaatkenmerken: 100%, normalisatiemodus: totale hoeveelheid peptiden, eiwitabundantie Berekening: opgetelde hoeveelheden , Top N: 3. Gegevens werden verder verwerkt met behulp van RStudio (versie 1.4.1106). Voor kwantitatieve vergelijking werden de gerapporteerde eiwitintensiteiten gebruikt. Vulkaanplots werden gegenereerd met het rstatix ​​R-pakket met behulp van een ongepaarde, tweezijdige Welch t-test en Benjamini-Hochberg-correctie om aangepaste p-waarden te berekenen of met GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) met behulp van een ongepaarde, tweezijdige meervoudige t-test en Benjamini, Krieger, en Yekutieli-correctie (valse ontdekkingsgraad: 0,05). Heatmaps en z-scores werden gegenereerd met behulp van GraphPad Prism 9.0 of het ComplexHeatmap R-pakket (cluster_rows: proteïnen, cluster_number: 15).

Opname van fosfolipiden in fibroblasten

Fosfolipiden (elk 50 µM) werden gesuspendeerd in DMEM dat 10% FCS bevatte (behalve serumdepletie), krachtig gemengd en gedurende 20 minuten gesoniceerd bij 50°C om fosfolipidenblaasjes te vormen, die vervolgens werden toegevoegd aan het celkweekmedium. In combinatie met siRNA-behandeling werd medium met siRNA / lipofectamine RNAiMax-complex na 5 uur uitgewisseld tegen fosfolipide-bevattend medium.

Als alternatief werd PI (18: 1/18: 1) onmiddellijk in fibroblasten opgenomen met behulp van het Fuse-It-L-membraanfusiesysteem (Ibidi, Martinsried, Duitsland). In het kort werd PI(18:1/18:1) (10 nmol), opgelost in chloroform, toegevoegd aan het gevriesdroogde Fuse-It-L reagens en grondig gemengd. Het oplosmiddel werd verdampt en het complex werd opnieuw gesuspendeerd in 20 mM HEPES pH 7,4 (25 µl) om het fusogene mengsel te verkrijgen dat gedurende 15 minuten onder 25°C werd gesonificeerd. Een aliquot (5-8 µl) werd verdund in PBS pH 7,4 (0,5 ml) en overgebracht naar fibroblasten (3,5 x ¹⁰⁵/putje van een plaat met 6 putjes), waarvan het kweekmedium is verwijderd. Na 5 minuten bij 37 °C werd het fusogene mengsel opnieuw vervangen door celkweekmedium. Omdat er sterke verschillen in opname van lipiden werden waargenomen tussen verschillende batches van de kit, hebben we de opname van PI (18:1/18:1) voor elke dataset gecontroleerd door UPLC-MS/MS. Succesvolle opname van lipiden werd gedefinieerd als een toename van ≥30% van de cellulaire PI(18:1/18:1)-verhoudingen.

Co-gereguleerde lipidenetwerken

Co-regulatie van lipiden werd gedefinieerd als Pearson-correlatiewaarden >0,7 en wordt gevisualiseerd in een willekeurig co-regulatienetwerk dat is geïmplementeerd in Cytoscape 3.3 (Cytoscape Consortium) ¹²⁹ . Netwerken werden berekend op basis van gemiddelde cellulaire lipidenverhoudingen en waren gecorreleerd met gemiddelde fosfo-p38 MAPK-niveaus. Negatieve correlatie van lipidesoorten met fosfo-p38 MAPK-niveaus wordt benadrukt voor Pearson-correlatiewaarden < −0,6. Pearson-waarden werden berekend met behulp van Microsoft Excel 2016 (Microsoft Office Professional Plus 2016, Microsoft, Redmond, WA). Netwerkknooppunten geven individuele lipidesoorten aan en randen tonen co-reguleringen boven de drempel.

Gegevensanalyse en statistiek

Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± sem van n onafhankelijke experimenten. Steekproeven waren niet geblindeerd en de steekproefomvang was niet vooraf bepaald door statistische methoden. Shapiro-Wilk-testen werden gebruikt om de gegevens te onderzoeken met vergelijkbare variantie tussen groepen voor normale verdeling. Niet-getransformeerde of logaritmische gegevens werden statistisch geëvalueerd door eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA’s voor onafhankelijke of gecorreleerde steekproeven, gevolgd door Tukey HSD post-hoctests of door een tweezijdige student- t – toets voor gepaarde of ongepaarde steekproeven met behulp van een tweezijdig α-niveau van 0,05. Pwaarden <0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Uitbijters werden bepaald met behulp van een Grubb’s test. Gegevens werden geanalyseerd met Microsoft Excel 2016 (Microsoft Office Professional Plus 2016, Microsoft) en statistische berekeningen werden uitgevoerd met SigmaPlot 13 en 14 (Systat Software GmbH, San Jose, CA), GraphPad InStat 3.10, GraphPad Prism 8.0 of GraphPad Prism 9.0 (GraphPad-software). Heatmaps zijn gemaakt met behulp van Morpheus ( https://software.broadinstitute.org/morpheus ) of GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software) van relatieve of absolute intensiteiten die werden genormaliseerd om te controleren. Hoofdcomponentenanalyse werd uitgevoerd met Origin 2020 (OriginLab, Northampton, MA).

Rapportage samenvatting

Meer informatie over het onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary die aan dit artikel is gekoppeld.

Beschikbaarheid van data

Brongegevens worden bij dit document geleverd.

De massaspectrometrische lipidomics-gegevens die in dit onderzoek zijn gegenereerd, zijn gedeponeerd in de Metabolomics Workbench-database (een internationale opslagplaats voor metabolomics-gegevens en metadata, metabolietstandaarden, protocollen, tutorials en training, en analysetools ¹³⁰ ) onder toegangscode ST001740 ¹³¹ . De massaspectrometrische proteomics-gegevens zijn gedeponeerd bij het ProteomeXchange Consortium via de PRIDE ¹³² – partnerrepository met de dataset-ID PXD025396 en PXD031890 . Alle andere gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd of geanalyseerd, worden verstrekt in dit gepubliceerde artikel, de Brongegevens, Aanvullende informatie of Aanvullende gegevens.

Verander geschiedenis

• 01 juni 2022Er is een oudere versie van het Peer Review-bestand geüpload. Deze is nu bijgewerkt.

Referenties

1. Costa-Mattioli, M. & Walter, P. De geïntegreerde stressrespons: van mechanisme tot ziekte. Wetenschap 368 , eaat5314 (2020).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
2. Hayes, JD, Dinkova-Kostova, AT & Tew, KD Oxidatieve stress bij kanker. Kankercel 38 , 167-197 (2020).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
3. Koeberle, A., Löser, K. & Thürmer, M. Stearoyl-CoA desaturase-1 en adaptieve stresssignalering. Biochim Biophys. Acta 1861 , 1719-1726 (2016).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
4. Stockwell, BR et al. Ferroptosis: een gereguleerde celdood-nexus die metabolisme, redoxbiologie en ziekte met elkaar verbindt. Cel 171 , 273-285 (2017).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
5. Johnson, GL & Lapadat, R. Door mitogeen geactiveerde eiwitkinaseroutes gemedieerd door ERK-, JNK- en p38-eiwitkinasen. Wetenschap 298 , 1911-1912 (2002).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
6. Wagner, EF & Nebreda, AR Signaalintegratie door JNK en p38 MAPK-routes bij de ontwikkeling van kanker. Nat. Rev. Kreeft 9 , 537-549 (2009).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
7. Ozcan, L. & Tabas, I. De rol van endoplasmatisch reticulumstress bij metabole ziekten en andere aandoeningen. Annu Rev Med 63 , 317-328 (2012).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
8. Green, DR & Levine, B. Zijn of niet zijn? Hoe selectieve autofagie en celdood het lot van de cel bepalen. Cel 157 , 65-75 (2014).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
9. Igea, A. & Nebreda, AR De stresskinase p38alpha als doelwit voor kankertherapie. Kankeronderzoek 75 , 3997-4002 (2015).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
10. Trempolec, N., Dave-Coll, N. & Nebreda, AR SnapShot: p38 MAPK-signalering. Cel 152 , 656-656 e651 (2013).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
11. Kumar, GS et al. Dynamische activering en regulatie van het door mitogeen geactiveerde eiwitkinase p38. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 115 , 4655-4660 (2018).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
12. Liu, S. et al. Grootte-uniformiteit van dierlijke cellen wordt actief gehandhaafd door een p38 MAPK-afhankelijke regulatie van G1-lengte. Elife 7 , e26947 (2018).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
13. Hetz, C., Chevet, E. & Oakes, SA Proteostasecontrole door de ongevouwen eiwitrespons. Nat. Cel biol. 17 , 829-838 (2015).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
14. Hij, Y. et al. p38 MAPK remt autofagie en bevordert microgliale ontstekingsreacties door ULK1 te fosforyleren. J. Cel Biol. 217 , 315-328 (2018).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
15. Henson, SM et al. p38-signalering remt mTORC1-onafhankelijke autofagie in senescente menselijke CD8 (+) T-cellen. J Clin. Investeren 124 , 4004-4016 (2014).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
16. Rashid, HO, Yadav, RK, Kim, HR & Chae, HJ ER-stress: inductie, remming en selectie van autofagie. Autofagie 11 , 1956-1977 (2015).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
17. Li, W. et al. Fosforylering van LAMP2A door p38 MAPK koppelt ER-stress aan chaperonne-gemedieerde autofagie. Nat. gemeenschappelijk. 8 , 1763 (2017).Artikel ADVERTENTIES PubMed PubMed Centraal CAS Google geleerde 
18. Rudalska, R. et al. In vivo RNAi-screening identificeert een mechanisme van sorafenib-resistentie bij leverkanker. Nat. Medio 20 , 1138-1146 (2014).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
19. Hetz, C., Axten, JM & Patterson, JB Farmacologische targeting van de ongevouwen eiwitrespons voor ziekte-interventie. Nat. Chem. Biol. 15 , 764-775 (2019).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
20. Levine, B. & Kroemer, G. Biologische functies van autofagiegenen: een ziekteperspectief. Cel 176 , 11-42 (2019).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
21. Liu, J. et al. Autofagie-afhankelijke ferroptose: machines en regulering. Cel Chem. Biol. 27 , 420-435 (2020).Artikel PubMed PubMed Centraal CAS Google geleerde 
22. Zheng, J. & Conrad, M. De metabolische onderbouwing van ferroptose. Cel Metab. 32 , 920-937 (2020).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
23. Friedmann Angeli, JP, Krysko, DV & Conrad, M. Ferroptosis op het kruispunt van door kanker opgelopen medicijnresistentie en immuunontwijking. Nat. Rev. Kreeft 19 , 405-414 (2019).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
24. Hodson, L. & Fielding, BA Stearoyl-CoA-desaturase: schurk of onschuldige omstander? prog. Lipid Res 52 , 15-42 (2013).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
25. Listenberger, LL et al. Ophoping van triglyceriden beschermt tegen vetzuurgeïnduceerde lipotoxiciteit. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 100 , 3077-3082 (2003).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
26. Hardy, S., Langelier, Y. & Prentki, M. Oleate activeert fosfatidylinositol 3-kinase en bevordert proliferatie en vermindert apoptose van MDA-MB-231 borstkankercellen, terwijl palmitaat tegengestelde effecten heeft. kanker res. 60 , 6353-6358 (2000).CAS PubMed Google geleerde 
27. Bai, Y. et al. Röntgenstructuur van een zoogdierstearoyl-CoA-desaturase. Natuur 524 , 252-256 (2015).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
28. Koeberle, A., Shindou, H., Harayama, T. & Shimizu, T. Palmitoleate is een mitogeen, gevormd na stimulatie met groeifactoren en omgezet in palmitoleoyl-fosfatidylinositol. J. Biol. Chem. 287 , 27244-27254 (2012).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
29. Koeberle, A. et al. De rol van p38-mitogeen-geactiveerd eiwitkinase bij het koppelen van stearoyl-CoA-desaturase-1-activiteit met homeostase van het endoplasmatisch reticulum. FASEB J. 29 , 2439-2449 (2015).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
30. Magtanong, L. et al. Exogene enkelvoudig onverzadigde vetzuren bevorderen een ferroptose-resistente celtoestand. Cel Chem. Biol. 26 , 420-432 e429 (2019).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
31. Tesfay, L. et al. Stearoyl-CoA-desaturase 1 beschermt eierstokkankercellen tegen ferroptotische celdood. Kankeronderzoek 79 , 5355-5366 (2019).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
32. Zhang, Z., Dales, NA & Winther, MD Kansen en uitdagingen bij de ontwikkeling van stearoyl-co-enzym A-desaturase-1-remmers als nieuwe therapieën voor ziekten bij de mens. J Med. Chem. 57 , 5039-5056 (2014).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
33. Theodoropoulos, PC et al. Ontdekking van tumorspecifieke onomkeerbare remmers van stearoyl-CoA-desaturase. Nat. Chem. Biol. 12 , 218-225 (2016).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
34. Shimizu, T. Lipid-mediatoren bij gezondheid en ziekte: enzymen en receptoren als therapeutische doelen voor de regulatie van immuniteit en ontsteking. Annu. Eerwaarde Pharm. Toxicol. 49 , 123-150 (2009).Artikel CAS Google geleerde 
35. Nile, AH & Hannoush, RN Vetacylering van Wnt-eiwitten. Nat. Chem. Biol. 12 , 60-69 (2016).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
36. Harayama, T. & Riezman, H. Inzicht in de diversiteit van de samenstelling van membraanlipiden. Nat. Ds Mol. Cel biol. 19 , 281-296 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
37. Antonny, B., Vanni, S., Shindou, H. & Ferreira, T. Van nul tot zes dubbele bindingen: fosfolipide-onverzadiging en organelfunctie. Trends Cell Biol. 25 , 427-436 (2015).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
38. Alvarado-Kristensson, M. & Andersson, T. Eiwitfosfatase 2A reguleert apoptose in neutrofielen door zowel p38 MAPK als zijn substraat caspase 3 te defosforyleren. J. Biol. Chem. 280 , 6238-6244 (2005).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
39. Kim, SI, Kwak, JH, Wang, L. & Choi, ME Eiwitfosfatase 2A is een negatieve regulator van transformerende groeifactor-beta1-geïnduceerde TAK1-activering in mesangiale cellen. J. Biol. Chem. 283 , 10753-10763 (2008).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
40. Fritz, A. et al. Fosforylering van serine 526 is vereist voor MEKK3-activiteit en associatie met 14-3-3 blokkeert defosforylering. J. Biol. Chem. 281 , 6236-6245 (2006).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
41. Hetz, C., Zhang, K. & Kaufman, RJ Mechanismen, regulatie en functies van de ongevouwen eiwitrespons. Nat. Ds Mol. Cel biol. 21 , 421-438 (2020).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
42. Wong, PM, Feng, Y., Wang, J., Shi, R. & Jiang, X. Regulering van autofagie door gecoördineerde actie van mTORC1 en eiwitfosfatase 2A. Nat. gemeenschappelijk. 6 , 8048 (2015).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
43. Lawrie, AM et al. Remming van proteïnekinase door staurosporine onthuld in details van de moleculaire interactie met CDK2. Nat. structuur. Biol. 4 , 796-801 (1997).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
44. Siegel, MR & Sisler, HD Remming van eiwitsynthese in vitro door cycloheximide. Nature 200 , 675-676 (1963).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
45. Long, BH, Musial, ST & Brattain, MG Enkel- en dubbelstrengs DNA-breuk en herstel in menselijke longadenocarcinoomcellen die zijn blootgesteld aan etoposide en teniposide. kanker res. 45 , 3106-3112 (1985).CAS PubMed Google geleerde 
46. Daniele, RP & Holian, SK Een kaliumionofoor (valinomycine) remt de proliferatie van lymfocyten door zijn effecten op het celmembraan. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 73 , 3599-3602 (1976).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
47. Thastrup, O., Cullen, PJ, Drobak, BK, Hanley, MR & Dawson, AP Thapsigargin, een tumorpromotor, ontlaadt intracellulaire Ca2+-voorraden door specifieke remming van het endoplasmatisch reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 87 , 2466-2470 .Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
48. Wiechmann, K. et al. Mitochondriale chaperonine HSP60 is het apoptose-gerelateerde doelwit voor myrtucommulone. Cel Chem. Biol. 24 , 614-623 e616 (2017).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
49. Hoessel, R. et al. Indirubine, het actieve bestanddeel van een Chinees geneesmiddel tegen leukemie, remt cycline-afhankelijke kinasen. Nat. Cel biol. 1 , 60-67 (1999).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
50. Leclerc, S. et al. Indirubines remmen glycogeensynthasekinase-3 beta en CDK5/p25, twee eiwitkinasen die betrokken zijn bij abnormale tau-fosforylering bij de ziekte van Alzheimer. Een eigenschap die de meeste cycline-afhankelijke kinaseremmers gemeen hebben? J. Biol. Chem. 276 , 251-260 (2001).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
51. Cook, JL, Walker, TA, Worthen, GS & Radke, JR De rol van het E1A Rb-bindende domein bij de onderdrukking van de NF-kappa B-afhankelijke afweer tegen tumornecrosefactor-alfa. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 99 , 9966-9971 (2002).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
52. Shayman, JA, Kelly, R., Kollmeyer, J., He, Y. & Abe, A. Groep XV fosfolipase A(2), een lysosomale fosfolipase A(2). prog. Lipiden Res . 50 , 1–13 (2011).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
53. Sundberg, JP et al. Asebia-2J (Scd1(ab2J)): een nieuw allel en een model voor alopecia met littekens. Ben. J Pathol. 156 , 2067-2075 (2000).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
54. Gowda, SGB et al. Ongerichte lipidomische analyse van plasma van vetrijke, door voeding geïnduceerde zwaarlijvige ratten met behulp van UHPLC-lineaire trap quadrupool-orbitrap MS. Anaal. Wetenschap. 36 , 821-828 (2020).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
55. Magee, WE, Goff, CW, Schoknecht, J., Smith, MD & Cherian, K. De interactie van kationische liposomen die ingesloten mierikswortelperoxidase bevatten met cellen in kweek. J. Cel Biol. 63 , 492-504 (1974).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
56. Valentijn, WJ et al. Update en nomenclatuurvoorstel voor lysofosfolipide-acyltransferasen van zoogdieren die membraanfosfolipidendiversiteit creëren. J. Biol Chem. , 101470 1–25 (2021).
57. Kita, Y., Shindou, H. & Shimizu, T. Cytosolische fosfolipase A2 en lysofosfolipide-acyltransferasen. Biochim Biophys. Acta Mol. Cel biol. Lipiden 1864 , 838-845 (2019).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
58. Pohl, C. & Dikic, I. Cellulaire kwaliteitscontrole door het ubiquitine-proteasoomsysteem en autofagie. Wetenschap 366 , 818-822 (2019).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
59. Katsuragi, Y., Ichimura, Y. & Komatsu, M. p62/SQSTM1 functioneert als een signaalhub en een autofagie-adapter. FEBS J. 282 , 4672-4678 (2015).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
60. Doherty, J. & Baehrecke, EH Leven, dood en autofagie. Nat. Cel biol. 20 , 1110-1117 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
61. Jiang, X., Overholtzer, M. & Thompson, CB Autofagie in cellulair metabolisme en kanker. J Clin. Investeren 125 , 47-54 (2015).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
62. Cubillos-Ruiz, JR, Bettigole, SE & Glimcher, LH Tumorigene en immunosuppressieve effecten van endoplasmatisch reticulumstress bij kanker. Cel 168 , 692-706 (2017).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
63. Naguib, A. et al. p53-mutaties veranderen de samenstelling van de fosfatidylinositolacylketen. Celvertegenwoordiger 10 , 8–19 (2015).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
64. Schuster, C. et al. De samenwerkende mutatie of “tweede treffer” bepaalt de immunologische zichtbaarheid van door MYC geïnduceerde muizenlymfomen. Bloed 118 , 4635-4645 (2011).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
65. Kim, J., Kundu, M., Viollet, B. & Guan, KL AMPK en mTOR reguleren autofagie door directe fosforylering van Ulk1. Nat. Cel biol. 13 , 132-141 (2011).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
66. Rehbein, U. et al. De TSC Complex-mTORC1-as: van lysosomen tot stresskorrels en terug. Front Cell-ontwikkelaar Biol. 9 , 751892 (2021).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
67. Liu, G. et al. Sorafenib doodt leverkankercellen door SCD1-gemedieerde synthese van enkelvoudig onverzadigde vetzuren te verstoren via de ATP-AMPK-mTOR-SREBP1-signaalroute. FASEB J. 33 , 10089-10103 (2019).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
68. Messner, M. et al. Metabole implicatie van tigecycline als een effectieve tweedelijnsbehandeling voor sorafenib-resistent hepatocellulair carcinoom. FASEB J. 34 , 11860-11882 (2020).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
69. Nikolich-Zugich, J. De schemering van immuniteit: opkomende concepten bij veroudering van het immuunsysteem. Nat. Immunol. 19 , 10–19 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
70. De Maeyer, RPH et al. Het blokkeren van verhoogde p38 MAPK herstelt efferocytose en ontstekingsresolutie bij ouderen. Nat. Immunol. 21 , 615-625 (2020).Artikel PubMed PubMed Centraal CAS Google geleerde 
71. Flach, J. et al. Replicatiestress is een krachtige oorzaak van functionele achteruitgang in verouderende hematopoëtische stamcellen. Natuur 512 , 198-202 (2014).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
72. Lin, YF & Haynes, CM Metabolisme en de UPR(mt). mol. Cel 61 , 677-682.Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
73. Ito, K. et al. Reactieve zuurstofsoorten werken via p38 MAPK om de levensduur van hematopoietische stamcellen te beperken. Nat. Medio 12 , 446-451 (2006).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
74. Fali, T. et al. Oudere menselijke hematopoietische voorlopercellen brengen cellulaire senescentiemarkers tot expressie en zijn vatbaarder voor pyroptose. JCI Inzicht 3 , e95319 (2018).
75. Bishop, NA, Lu, T. & Yankner, BA Neurale mechanismen van veroudering en cognitieve achteruitgang. Natuur 464 , 529-535 (2010).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
76. Guevara, R. et al. Geslachtsafhankelijke verschillen in de mitochondriale functie van oudere rattenhersenen en oxidatieve stress. Gratis radicaal. Biol. Med. 46 , 169-175 (2009).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
77. Gutierrez-Gutierrez, O. et al. Regeneratie bij uitgehongerde planariërs hangt af van TRiC/CCT-subeenheden die de ongevouwen eiwitrespons moduleren. EMBO Rep. 22 , e52905 (2021).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
78. Arnold, CP et al. Pathogene verschuivingen in endogene microbiota belemmeren weefselregeneratie via duidelijke activering van TAK1/MKK/p38. Elife 5 , e16793 (2016).
79. Chamoli, M. et al. Meervoudig onverzadigde vetzuren en p38-MAPK koppelen metabole herprogrammering aan cytoprotectieve genexpressie tijdens dieetbeperkingen. Nat. gemeenschappelijk. 11 , 4865 (2020).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
80. Chovatiya, R. & Medzhitov, R. Stress, ontsteking en verdediging van homeostase. mol. Cel 54 , 281-288 (2014).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
81. Schulze-Spate, U. et al. Relatie tussen biomarkers voor botmetabolisme en parodontitis: de studie naar osteoporotische fracturen bij mannen (MrOS). J Clin. Endocrinol. metab. 100 , 2425-2433 (2015).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
82. Muluke, M. et al. Door voeding veroorzaakte obesitas en de differentiële impact ervan op parodontaal botverlies. J. Dent. Res. 95 , 223-229 (2016).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
83. Green, DR & Kroemer, G. De pathofysiologie van mitochondriale celdood. Wetenschap 305 , 626-629 (2004).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
84. Lu, G., Morinelli, TA, Meier, KE, Rosenzweig, SA & Egan, BM Door oliezuur geïnduceerde mitogene signalering in vasculaire gladde spiercellen. Een rol voor proteïnekinase C. Circ. Res. 79 , 611-618 (1996).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
85. Rahman, SM et al. Stearoyl-CoA-desaturase 1-deficiëntie verhoogt insulinesignalerende componenten en reguleert proteïne-tyrosinefosfatase 1B in spieren. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 100 , 11110-11115 (2003).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
86. Ntambi, JM et al. Verlies van stearoyl-CoA desaturase-1-functie beschermt muizen tegen adipositas. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 99 , 11482-11486 (2002).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
87. Gutiérrez-Juarez, R. et al. Kritieke rol van stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD1) bij het ontstaan ​​van door voeding geïnduceerde hepatische insulineresistentie. J Clin. Investeren 116 , 1686-1695 (2006).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
88. Singh, V. et al. Microbiota-afhankelijke hepatische lipogenese gemedieerd door stearoyl CoA desaturase 1 (SCD1) bevordert het metabool syndroom bij TLR5-deficiënte muizen. Cel Metab. 22 , 983-996 (2015).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
89. Dobrzyn, P., Bednarski, T. & Dobrzyn, A. Metabole herprogrammering van het hart door stearoyl-CoA-desaturase. prog. Lipiden Res . 57 , 1–12 (2015).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
90. Zheng, Y. et al. Scd1 komt tot expressie in talgklieren en wordt verstoord in de asebia-muis. Nat. Genet 23 , 268-270 (1999).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
91. Igal, RA Stearoyl CoA desaturase-1: nieuwe inzichten in een centrale regulator van het metabolisme van kanker. Biochim. Biophys. Acta 1861 , 1865-1880 (2016).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
92. Du, X. et al. FGFR3 stimuleert de activiteit van stearoyl-CoA-desaturase 1 om de groei van blaastumoren te bevorderen. Kankeronderzoek 72 , 5843-5855 (2012).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
93. Liu, G. et al. Longfibroblasten bevorderen metastatische kolonisatie door opregulering van stearoyl-CoA-desaturase 1 in tumorcellen. Oncogen 37 , 1519-1533 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
94. Noto, A. et al. Stearoyl-CoA-desaturase 1 reguleert de stengel van longkanker via stabilisatie en nucleaire lokalisatie van YAP/TAZ. Oncogen36 , 4573-4584 (2017).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
95. Ma, MKF et al. Stearoyl-CoA-desaturase reguleert sorafenib-resistentie via modulatie van door ER-stress geïnduceerde differentiatie. J. Hepatol. 67 , 979-990 (2017).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
96. Mziaut, H., Korza, G. & Ozols, J. Het N-uiteinde van microsomaal delta 9 stearoyl-CoA-desaturase bevat de sequentie die bepalend is voor de snelle afbraak ervan. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 97 , 8883-8888 (2000).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
97. Tan, SH et al. Kritieke rol van SCD1 in autofagie-regulatie via lipogenese en aan lipide-vlotten gekoppelde AKT-FOXO1-signaalroute. Autofagie 10 , 226-242 (2014).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
98. Holzer, RG et al. Verzadigde vetzuren induceren c-Src-clustering binnen membraansubdomeinen, wat leidt tot JNK-activering. Cel 147 , 173-184 (2011).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
99. Volmer, R., van der Ploeg, K. & Ron, D. Membraanlipidenverzadiging activeert endoplasmatisch reticulum ongevouwen eiwitresponstransducers via hun transmembraandomeinen. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 110 , 4628-4633 (2013).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
100. Kitai, Y. et al. Membraanlipidenverzadiging activeert IRE1alpha zonder clustering te veroorzaken. Genencellen 18 , 798-809 (2013).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
101. Masuda, M. et al. Verzadigde fosfatidinezuren bemiddelen door verzadigd vetzuur geïnduceerde vasculaire calcificatie en lipotoxiciteit. J Clin. Investeren 125 , 4544-4558 (2015).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
102. Manning, BD & Toker, A. AKT/PKB-signalering: navigeren op het netwerk. Cel 169 , 381-405 (2017).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
103. Yin, HL & Janmey, PA Phosphoinositide-regulatie van het actine-cytoskelet. Annu. Eerwaarde Physiol. 65 , 761-789 (2003).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
104. Liu, J. et al. Enkelvoudig onverzadigde vetzuren gegenereerd via stearoyl CoA desaturase-1 zijn endogene remmers van vetzuuramidehydrolase. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 110 , 18832-18837 (2013).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
105. Itoh, Y. et al. Vrije vetzuren reguleren de insulinesecretie door bètacellen van de alvleesklier via GPR40. Natuur 422 , 173-176 (2003).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
106. Rios-Esteves, J. & Resh, MD Stearoyl CoA-desaturase is vereist om actieve, lipide-gemodificeerde Wnt-eiwitten te produceren. Cell Rep. 4 , 1072-1081 (2013).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
107. Eichhorn, PJ, Creyghton, MP & Bernards, R. Eiwitfosfatase 2A regulerende subeenheden en kanker. Biochim Biophys. Acta 1795 , 1–15 (2009).CAS PubMed Google geleerde 
108. Klionsky, DJ et al. Richtlijnen voor het gebruik en de interpretatie van assays voor het monitoren van autofagie (4e editie)(1). Autofagie 17 , 1–382 (2021).Artikel PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
109. Ascenzi, F. et al. SCD1, autofagie en kanker: implicaties voor therapie. J. Exp. Clin. Kanker Res . 40. 265 (2021).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
110. Di Paolo, G. & De Camilli, P. Phosphoinositides in celregulatie en membraandynamiek. Natuur 443 , 651-657 (2006).Artikel ADVERTENTIES PubMed CAS Google geleerde 
111. Jaffe, EA, Nachman, RL, Becker, CG & Minick, CR Cultuur van menselijke endotheelcellen afgeleid van navelstrengaderen. Identificatie door morfologische en immunologische criteria. J Clin. Investeren 52 , 2745-2756 (1973).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
112. Pein, H. et al. Endogene metabolieten van vitamine E beperken ontstekingen door zich te richten op 5-lipoxygenase. Nat. gemeenschappelijk. 9 , 3834 (2018).Artikel ADVERTENTIES PubMed PubMed Centraal CAS Google geleerde 
113. Koeberle, A., Shindou, H., Harayama, T. & Shimizu, T. De rol van lysofosfatidinezuuracyltransferase 3 voor de levering van sterk meervoudig onverzadigde vetzuren in TM4 Sertoli-cellen. FASEB J. 24 , 4929-4938 (2010).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
114. Koeberle, A., Shindou, H., Harayama, T., Yuki, K. & Shimizu, T. Meervoudig onverzadigde vetzuren worden opgenomen in rijpende kiemcellen van mannelijke muizen door lysofosfatidinezuuracyltransferase 3. FASEB J. 26 , 169-180 ( 2012).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
115. Glatzel, DK et al. Acetyl-CoA-carboxylase 1 reguleert de migratie van endotheelcellen door de samenstelling van fosfolipiden te verschuiven. J. Lipid Res. 59 , 298-311 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
116. Espada, L. et al. Verlies van metabole plasticiteit ligt ten grondslag aan metformine-toxiciteit bij oude Caenorhabditis elegans. Nat. metab. 2 , 1316-1331 (2020).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
117. Koeberle, A. et al. Arachidonoyl-fosfatidylcholine oscilleert tijdens de celcyclus en gaat proliferatie tegen door Akt-membraanbinding te onderdrukken. Proc. Natl. Acad. Wetenschap. VS 110 , 2546-2551 (2013).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
118. Ema, H. et al. Hematopoëtische stamcellen van volwassen muizen: zuivering en eencellige assays. Nat. Protocol. 1 , 2979-2987 (2006).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
119. Adams, JM et al. Het c-myc-oncogen, aangedreven door immunoglobulineversterkers, induceert lymfoïde maligniteit bij transgene muizen. Nature 318 , 533-538 (1985).Artikel ADVERTENTIES CAS PubMed Google geleerde 
120. Gonzalez-Estevez, C. et al. SMG-1 en mTORC1 werken antagonistisch om de respons op letsel en groei bij planariërs te reguleren. PLoS Genet8 , e1002619 (2012).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
121. Li, GZ et al. Database zoeken en boekhouden van gemultiplexte voorloper- en productie-ionenspectra uit de gegevensonafhankelijke analyse van eenvoudige en complexe peptidemengsels. Proteomica 9 , 1696-1719 (2009).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
122. Silva, JC, Gorenstein, MV, Li, GZ, Vissers, JP & Geromanos, SJ Absolute kwantificering van eiwitten door LCMSE: een deugd van parallelle MS-acquisitie. mol. Cel Proteoom. 5 , 144-156 (2006).Artikel CAS Google geleerde 
123. Balla, T. Phosphoinositides: kleine lipiden met een enorme impact op de celregulatie. fysio. 93 , 1019-1137 (2013).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
124. Valentijn, WJ et al. Update en nomenclatuurvoorstel voor lysofosfolipide-acyltransferasen van zoogdieren, die membraanfosfolipidendiversiteit creëren. J. Biol. Chem. 298 , 101470 (2022).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
125. Park, JB et al. Fosfolipase-signaleringsnetwerken bij kanker. Nat. Rev. Kreeft 12 , 782-792 (2012).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
126. Zer, C., Sachs, G. & Shin, JM Identificatie van genomische doelen stroomafwaarts van p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinaseroute die tumornecrosefactor-alfa-signalering bemiddelt. fysio. Genomica 31 , 343-351 (2007).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
127. Dikic, I. & Elazar, Z. Mechanisme en medische implicaties van autofagie bij zoogdieren. Nat. Ds Mol. Cel biol. 19 , 349-364 (2018).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
128. Hansen, M., Rubinsztein, DC & Walker, DW Autofagie als promotor van een lang leven: inzichten van modelorganismen. Nat. Ds Mol. Cel biol. 19 , 579-593 (2018).Artikel CAS PubMed PubMed Centraal Google geleerde 
129. Koberlin, MS et al. Een geconserveerd circulair netwerk van coregereguleerde lipiden moduleert aangeboren immuunresponsen. Cel 162 , 170-183 (2015).Artikel PubMed PubMed Centraal CAS Google geleerde 
130. Sud, M. et al. Metabolomics Workbench: een internationale opslagplaats voor metabolomics-gegevens en metadata, metabolietstandaarden, protocollen, tutorials en training, en analysetools. Nucleïnezuren Res. 44 , D463-D470 (2016).Artikel CAS PubMed Google geleerde 
131. Thuermer, M. et al. Regulatie van stresssignalering door van SCD1 afgeleide fosfatidylinositolen. Metabolomics-werkbank https://doi.org/10.21228/M8Q39V (2022).
132. Perez-Riverol, Y. et al. PRIDE-inspecteurstoolsuite: op weg naar een universele visualisatietool voor proteomics-gegevensstandaardformaten en kwaliteitsbeoordeling van proteomeXchange-datasets. mol. Cel Proteoom. 15 , 305-317 (2016).Artikel CAS Google geleerde 

Referenties downloaden

Dankbetuigingen

We danken Felix Benscheidt, Yvonne Hupfer, Vajiheh Jafari, Viktoria Iffarth, Martin Niebergall, Jinghong Peng, Katrin Schubert, Vanessa Sorge, Franziska Stanzel en Maria Völkel voor technische assistentie bij het uitvoeren van experimentele methoden en Simona Pace voor overleg bij het ontwerp van muisstudies .

AK werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksraad (GRK 1715 en KO 4589/4-1), het Phospholipid Research Center (AKO-2022-100/2-2, AKO-2019-070/2-1, AKO-2015-037 /1-1), de Universiteit van Jena (DRM/2013-05 en 2.7-05), en een Strategie- en Innovatiebeurs van de Vrijstaat Thüringen (41-5507-2016) en de Leibniz ScienceCampus InfectoOptics (SAS-2015 -HKI-LWC). RW werd ondersteund door de Carl Zeiss-stichting. CG-E. werd gefinancierd door het Leibniz Institute on Aging-Fritz Lipmann Institute (FLI) en heeft momenteel een Maria Zambrano-fellowship (oproep tot herkwalificatie van het Spaanse universitaire systeem 2021-2023) aan de Universiteit van Barcelona. De FLI is lid van de Leibniz Association en wordt financieel ondersteund door de Bondsregering van Duitsland en de deelstaat Thüringen. US-S werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek van het Universitair Ziekenhuis Jena (IZKF UKJ FF02) en het Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (01EC1901B, Project 2). KT erkent de steun van het MESI-STRAT-project (subsidieovereenkomst 754688), het PoLiMeR Innovative Training Network (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst 812616) en het ARDRE COFUND-trainingsnetwerk (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 847681), die allemaal financiering ontvingen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie; de Duitse Tubereuze Sclerose Stichting en Stichting TSC Fonds. MK werd ondersteund door de Universiteit van Innsbruck (projectnr.: 316826) en het Tiroler Onderzoeksfonds (projectnr.: 18903). KT erkent de steun van het MESI-STRAT-project (subsidieovereenkomst 754688), het PoLiMeR Innovative Training Network (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst 812616) en het ARDRE COFUND-trainingsnetwerk (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 847681), die allemaal financiering ontvingen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie; de Duitse Tubereuze Sclerose Stichting en Stichting TSC Fonds. MK werd ondersteund door de Universiteit van Innsbruck (projectnr.: 316826) en het Tiroler Onderzoeksfonds (projectnr.: 18903). KT erkent de steun van het MESI-STRAT-project (subsidieovereenkomst 754688), het PoLiMeR Innovative Training Network (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst 812616) en het ARDRE COFUND-trainingsnetwerk (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 847681), die allemaal financiering ontvingen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie; de Duitse Tubereuze Sclerose Stichting en Stichting TSC Fonds. MK werd ondersteund door de Universiteit van Innsbruck (projectnr.: 316826) en het Tiroler Onderzoeksfonds (projectnr.: 18903). het PoLiMeR Innovative Training Network (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst 812616) en het ARDRE COFUND-trainingsnetwerk (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 847681) die allemaal financiering ontvingen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie; de Duitse Tubereuze Sclerose Stichting en Stichting TSC Fonds. MK werd ondersteund door de Universiteit van Innsbruck (projectnr.: 316826) en het Tiroler Onderzoeksfonds (projectnr.: 18903). het PoLiMeR Innovative Training Network (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst 812616) en het ARDRE COFUND-trainingsnetwerk (Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 847681) die allemaal financiering ontvingen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie; de Duitse Tubereuze Sclerose Stichting en Stichting TSC Fonds. MK werd ondersteund door de Universiteit van Innsbruck (projectnr.: 316826) en het Tiroler Onderzoeksfonds (projectnr.: 18903).

Auteurs informatie

Aantekeningen van de auteur

1. Deze auteurs hebben in gelijke mate bijgedragen: André Gollowitzer, Helmut Pein, Konstantin Neukirch.

Auteurs en affiliaties

1. Leerstoel Farmaceutische/Medicinale Chemie, Instituut voor Farmacie, Friedrich-Schiller-Universiteit Jena, 07743, Jena, DuitslandMaria Thürmer, Helmut Pein, Elif Gelmez, Konstantin Löser, Fabiana Troisi & Andreas Koeberle
2. Michael Popp Instituut en Centrum voor Moleculaire Biowetenschappen Innsbruck (CMBI), Universiteit van Innsbruck, 6020, Innsbruck, OostenrijkAndré Gollowitzer, Konstantin Neukirch, Lorenz Waltl, Julia Grander & Andreas Koeberle
3. Onderzoeksgroep Massaspectrometrie en Proteomics, Max Planck Instituut voor Chemische Ecologie, 07745, Jena, DuitslandNatalie Wielsch & Aleš Svatoš
4. Afdeling Biochemie, Centrum voor Moleculaire Biogeneeskunde (CMB), Friedrich-Schiller-Universiteit Jena, 07745, Jena, DuitslandRené Winkler & Christian Kosan
5. Instituut voor Biochemie en Centrum voor Moleculaire Biowetenschappen Innsbruck, Universiteit van Innsbruck, 6020, Innsbruck, OostenrijkMadlen Hotze, Kathrin Thedieck en Marcel Kwiatkowski
6. Instituut voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde, Sectie Massaspectrometrie en Proteomics, Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf, 20246, Hamburg, DuitslandSoenke Harder & Hartmut Schlueter
7. Sectie Geriatrische Tandheelkunde, Centrum voor Tandheelkunde, Universitair Ziekenhuis Jena, Friedrich-Schiller-Universiteit Jena, 07743, Jena, DuitslandAnnika Doding & Ulrike Schulze-Späte
8. Afdeling Farmacie, Farmaceutische Biologie, LMU München, 81377, München, DuitslandMartina Meßner, Maximilian Ardelt & Johanna Pachmayr
9. Instituut voor Farmacie, Paracelsus Medical University, 5020, Salzburg, OostenrijkMartina Meßner, Maximilian Ardelt & Johanna Pachmayr
10. Leibniz Instituut voor Veroudering—Fritz Lipmann Instituut (FLI), 07745, Jena, DuitslandÓscar Gutiérrez-Gutiérrez & Cristina González-Estevez
11. Onderzoeksgroep stamcelveroudering, Leibniz Institute on Aging – Fritz Lipmann Institute (FLI), 07745, Jena, DuitslandKarl Lenhard Rudolf
12. Laboratorium voor Kindergeneeskunde, Sectie Systeemgeneeskunde van Metabolisme en Signalering, Rijksuniversiteit Groningen, Universitair Medisch Centrum Groningen, 9713 AV, Groningen, NederlandKathrin Thedieck
13. Afdeling Neurowetenschappen, School of Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University Oldenburg, 26129, Oldenburg, DuitslandKathrin Thedieck
14. Afdeling Genetica, Microbiologie en Statistiek, Faculteit Biologie, Universiteit van Barcelona, ​​08028, Barcelona, ​​SpanjeCristina Gonzalez-Estevez
15. Instituut voor Biomedicine van de Universiteit van Barcelona (IBUB), 08028, Barcelona, ​​SpanjeCristina Gonzalez-Estevez

bijdragen

AK ontwierp en MT, AG, HP, EG, LW, KL en JG voerden en analyseerden op cellen gebaseerde experimenten en voerden lipidomische studies uit. NW, MT en AS analyseerden de samenstelling van immunoprecipitaten door kwantitatieve proteomics. FT en AK ontwierpen en FT, MT, AG en KN voerden experimenten uit op murine peritoneale macrofagen, muizenhersenen en muizen met een defecte Scd1- mutatie. KL, RW en CK zorgden voor B-cellymfoom en voerden immunoblotting uit op respectievelijke celpopulaties. LR bereidde hematopoëtische stamcellen en myeloïde voorlopercellen van jonge en oude muizen. AD en US ontwierpen en voerden experimenten uit met betrekking tot P. gingivalisinfectie. MM, MA en JP genereerden de sorafenib-resistente hepatocarcinoomcellijn. CG-E en OG-G huisvestten en behandelden planariërs, voerden knockdown-experimenten uit op deze dieren en leverden transcriptoomgegevens. HS en KT leverden methodologie voor kwantitatieve proteomics. AG, MH, SH en MK voerden uit, en AG, MH, MK en AK analyseerden de gegevens van kwantitatieve proteomics. AK bedacht het project en AK en MT schreven het manuscript, dat werd bewerkt en goedgekeurd door alle auteurs.

Corresponderende auteur

Correspondentie met Andreas Koeberle .

Ethische verklaringen

Concurrerende belangen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Peer review

Informatie over collegiale toetsing

Nature Communications bedankt Martin Giera, Alexander Kapralov en de andere, anonieme reviewer(s) voor hun bijdrage aan de peer review van dit werk. Peer reviewer-rapporten zijn beschikbaar.

Extra informatie

Noot van de uitgever Springer Nature blijft neutraal met betrekking tot jurisdictieclaims in gepubliceerde kaarten en institutionele voorkeuren.

Aanvullende informatie

Aanvullende informatie

Peer Review-bestand

Beschrijving van aanvullende aanvullende bestanden

Aanvullende gegevens 1

Aanvullende gegevens 2

Aanvullende gegevens 3

Aanvullende gegevens 4

Aanvullende gegevens 5

Aanvullende gegevens 6

Samenvatting rapportage

Data bron

Data bron

Rechten en machtigingen

Open toegang Dit artikel is gelicenseerd onder een Creative Commons Attribution 4.0 International-licentie, die het gebruik, delen, aanpassen, verspreiden en reproduceren in elk medium of formaat toestaat, zolang u de oorspronkelijke auteur(s) en de bron op gepaste wijze vermeldt, geef een link naar de Creative Commons-licentie en geef aan of er wijzigingen zijn aangebracht. De afbeeldingen of ander materiaal van derden in dit artikel zijn opgenomen in de Creative Commons-licentie van het artikel, tenzij anders aangegeven in een kredietlijn bij het materiaal. Als materiaal niet is opgenomen in de Creative Commons-licentie van het artikel en het door u beoogde gebruik niet is toegestaan ​​door wettelijke voorschriften of het toegestane gebruik overschrijdt, moet u rechtstreeks toestemming krijgen van de houder van het auteursrecht. Ga naar om een ​​kopie van deze licentie te bekijkenhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ .

Herdrukken en machtigingen

Over dit artikel

Citeer dit artikel

Thürmer, M., Gollowitzer, A., Pein, H. et al. PI(18:1/18:1) is een van SCD1 afgeleid lipokine dat stresssignalering beperkt. Nat Commun 13 , 2982 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30374-9

Citaat downloaden

• Ontvangen09 maart 2021
• Geaccepteerd27 april 2022
• Gepubliceerd27 mei 2022
• DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-022-30374-9

Andreas Koeberle, hoofd van het Michael-Popp-Instituut, Universiteit van Innsbruck, Oostenrijk. Krediet: Alena Klinger